| A Sensitive and Specific PCR-based Assay to Quantify Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular (ccc) DNA while Preserving Cellular DNA
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Author:
Date:
2021-04-20
[Abstract] Hepatitis B virus (HBV) is the major cause of liver diseases and liver cancer worldwide. After infecting hepatocytes, the virus establishes a stable episome (covalently closed circular DNA, or cccDNA) that serves as the template for all viral transcripts. Specific and accurate quantification of cccDNA is difficult because infected cells contain abundant replicative intermediates of HBV DNA that share overlapping sequences but arranged in slightly different forms. HBV cccDNA can be detected by Southern blot or qPCR methods which involve enzymatic digestion. These assays are laborious, have limited sensitivity, or require degradation of cellular DNA (which precludes simple normalization). The method described in this protocol, cccDNA inversion quantitative (cinq)PCR, instead uses a series ...
[摘要] [摘要]乙型肝炎病毒（HBV）是全球范围内肝脏疾病和肝癌的主要原因。感染肝细胞后，病毒建立起稳定的附加体（共价闭合的环状DNA或cccDNA），作为所有病毒转录本的模板。cccDNA的特异性和准确定量非常困难，因为被感染的细胞含有丰富的HBV DNA复制中间体，这些中间体共享重叠序列，但排列形式略有不同。HBV cccDNA可以通过涉及酶消化的Southern印迹或qPCR方法进行检测。这些测定费力，灵敏度有限或需要细胞DNA降解（无法进行简单的标准化）。该协议中描述的方法cccDNA反向定量（cinq）PCR，而是使用一系列限制性酶介导的水解和连接反应，将cccDNA转化为反向线性扩增子，该扩增子无法从其他形式的HBV DNA扩增或检测到。重要的是，细胞DNA在样品制备过程中仍可定量，从而可以进行标准化并显着提高精确度。另外，第二线性片段（源自酶消化HBV DNA基因组的单独区域，并以所有形式的HBV DNA存在）可用于同时定量总HBV水平。
图形摘要：
HBV的cccDNA和总HBV DNA的选择性检测使用cinqPCR （转载自涂等人，2020一）。
[背景]乙型肝炎病毒（HBV）是一种小的有包膜病毒，其encapsidates一个部分双链环状DNA基因组，所谓松弛环状（RC）的DNA。感染人肝细胞后，核衣壳被转运至细胞核，其中rcDNA基因组被转化为共价闭合的环状（ccc）DNA。这种游离形式是高度稳定的，并保持慢性HBV感染（Tu等人，2020b ...
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| In vitro Differentiation of Human iPSC-derived Cardiovascular Progenitor Cells (iPSC-CVPCs)
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Induced pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitor cells (iPSC-CVPCs) provide an unprecedented platform for examining the molecular underpinnings of cardiac development and disease etiology, but also have great potential to play pivotal roles in the future of regenerative medicine and pharmacogenomic studies. Biobanks like iPSCORE ( Stacey et al., 2013; Panopoulos et al., 2017), which contain iPSCs generated from hundreds of genetically and ethnically diverse individuals, are an invaluable resource for conducting these studies. Here, we present an optimized, cost-effective and highly standardized protocol for large-scale derivation of human iPSC-CVPCs using small molecules and purification using metabolic selection. We have successfully applied this protocol ...
[摘要] [摘要 ] 诱导性多能干细胞衍生的心血管祖细胞（iPSC-CVPCs）为检查心脏发育和疾病病因的分子基础提供了前所未有的平台，但在再生医学和药物基因组学的未来中也具有重要作用。像iPSCORE这样的生物库（Stacey 等，2013 ；Panopoulos 等，2017）， 其中包含由数百个遗传和种族不同的个体产生的iPSC，是进行这些研究的宝贵资源。在这里，我们为小分子大规模衍生人iPSC-CVPCs和代谢选择纯化提供了一种优化，具有成本效益和高度标准化的方案。我们已经成功地应用了该协议，从154种不同的iPSCORE iPSC品系中获得了iPSC-CVPC，从而获得了大量的高纯度心脏细胞。一个重要的我们的协议的组成部分是Ç ELL Ç onfluency 估计S（ccEstimate ），用于估计当iPSC集单层将达到80％汇合，这是用于发起的iPSC-CVPC推导最佳的时间的自动方法，并且使得协议为易于在具有不同增长率的iPSC系列中使用。此外，我们发现跨iPSC-CVPC的细胞异质性是由于两种截然不同的心脏细胞类型（心肌细胞（CMs）和心外膜衍生细胞（EPDCs））的比例不同导致的，这两种细胞在心脏再生中均具有关键作用。该协议消除了iPSC线到线优化的需要，并且可以轻松地进行调整和扩展，以进行高通量研究或生成大量适用于再生医学应用的细胞。
[背景 ] ...
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