| Identification of Intrinsic RNA Binding Specificity of Purified Proteins by in vitro RNA Immunoprecipitation (vitRIP)
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] RNA-protein interactions are often mediated by dedicated canonical RNA binding domains. However, interactions through non-canonical domains with unknown specificity are increasingly observed, raising the question how RNA targets are recognized. Knowledge of the intrinsic RNA binding specificity contributes to the understanding of target selectivity and function of an individual protein.
The presented in vitro RNA immunoprecipitation assay (vitRIP) uncovers intrinsic RNA binding specificities of isolated proteins using the total cellular RNA pool as a library. Total RNA extracted from cells or tissues is incubated with purified recombinant proteins, RNA-protein complexes are immunoprecipitated and bound transcripts are identified by deep sequencing or quantitative RT-PCR. ...
[摘要] [摘要] RNA-蛋白质相互作用通常由专门的规范RNA结合域介导。然而，越来越多地观察到通过具有未知特异性的非经典结构域的相互作用，这提出了如何识别RNA靶标的问题。内在的RNA结合特异性的知识有助于理解单个蛋白质的靶标选择性和功能。
所呈现的体外RNA免疫沉淀测定法（vitRIP ）揭示固有RNA使用总细胞RNA池作为分离的蛋白质的结合特异性一个库。从细胞或组织中提取的总RNA与纯化的重组蛋白孵育，免疫沉淀RNA-蛋白复合物，并通过深度测序或定量RT-PCR鉴定结合的转录物。这些RNA中丰富的RNA类和核苷酸频率决定了重组蛋白的固有特异性。该简单而通用的方案可适用于任何细胞类型或组织的其他RNA结合蛋白和总RNA文库。
图形摘要：
图1.体外RNA免疫沉淀（vitRIP ）方案示意图
[背景]真核细胞包含许多不同的RNA类，具有成千上万的RNA种类以及与之相互作用的高度多样化的蛋白质。根据结合的RNA序列或结构的定义以及相互作用中涉及的蛋白质结构域的不同，RNA-蛋白质相互作用可分为特异性和非特异性（Jankowsky和Harris，2015）。越来越多地观察到通过未知特异性的非经典RNA结合结构域进行的RNA相互作用，这提出了如何识别专用RNA靶标的问题。 ...
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| Probe-Seq: Method for RNA Sequencing of Specific Cell Types from Animal Tissue
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Most organs and tissues are composed of many types of cells. To characterize cellular state, various transcription profiling approaches are currently available, including whole-tissue bulk RNA sequencing, single cell RNA sequencing (scRNA-Seq), and cell type-specific RNA sequencing. What is missing in this repertoire is a simple, versatile method for bulk transcriptional profiling of cell types for which cell type-specific genetic markers or antibodies are not readily available. We therefore developed Probe-Seq, which uses hybridization of gene-specific probes to RNA markers for isolation of specific types of cells, to enable downstream FACS isolation and bulk RNA sequencing. We show that this method can enable isolation and profiling of specific cell types from mouse retina, frozen human ...
[摘要] [摘要 ] 大多数器官和组织由许多类型的细胞组成。为了表征细胞状态，目前可以使用各种转录分析方法，包括全组织体RNA测序，单细胞RNA测序（scRNA -Seq）和特定于细胞类型的RNA测序。在此库中缺少的是一种简单，通用的方法，无法批量获得细胞类型的特定基因标记或抗体，因此无法批量转录。因此，我们开发了Probe-Seq，该探针使用基因特异性探针与RNA标记的杂交来分离特定类型的细胞，以实现下游FACS分离和大量RNA测序。我们表明，该方法可以实现从小鼠视网膜，冷冻人视网膜，果蝇中肠和发育中的雏鸡视网膜中分离和分析特定细胞类型的特征，这表明它对大多数生物很有用。
[背景技术 [ 0002 ] 在过去的二十年中，使用RNA-Seq和微阵列进行转录谱分析已在生物学研究中无处不在。分析现在是用来了解大多数生物体中细胞和细胞状态的主要工具之一。它被用于正常发育，异常发育和疾病的研究，并极大地扩展了我们对进化关系的理解。特别地，scRNA- Seq已经以前所未有的速度导致了新型细胞类型的鉴定（Picelli 等，2013；Jaitin 等，2014； Klein 等，2015； Macosko 等，2015）。为了更深入地了解这些新描述的细胞类型，一种无需转基因标记或特异性抗原即可将其分离的方法将大有裨益。尽管可以使用scRNA ...
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| Novel Protein-oligonucleotide Conjugation Method Involving a High-affinity Capture HaloTag
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Highly sensitive quantitative protein profiling can play a key role in the early diagnosis of diseases, such as autoimmune diseases and cancer. We developed a modified protein-oligonucleotide conjugation method termed HaloTag-mediated barcoding, for quantifying protein molecules at a higher sensitivity than conventional protein quantification methods. This novel and efficient conjugation method can be used to prepare HaloTag-barcoded proteins using a click chemistry-based labeling technique. Here, we describe the preparation of protein-DNA complexes and detection of protein-protein interactions which can be used in a HaloTag protein barcode assay to detect an antibody. The protocol includes procedures for preparing the ligand-oligonucleotide complex, plasmid DNA preparation for protein ...
[摘要] [摘要 ] 高灵敏度的定量蛋白质谱分析可以在疾病的早期诊断中发挥关键作用，例如自身免疫性疾病和癌症。我们开发了一种改良的蛋白质-寡核苷酸缀合方法，称为HaloTag 介导的条形码，用于以比常规蛋白质定量方法更高的灵敏度来定量蛋白质分子。可以使用这种基于点击化学的标记技术，将这种新颖而有效的结合方法用于制备HaloTag 条形码蛋白。在这里，我们描述了可在HaloTag中使用的蛋白质-DNA复合物的制备和蛋白质-蛋白质相互作用的检测 蛋白质条形码检测以检测抗体。该方案包括制备配体-寡核苷酸复合物的程序，用于蛋白质表达的质粒DNA制备以及蛋白质-寡核苷酸复合物的制备。所描述的基于点击反应的方案简化了常规胺-酯反应方法，该方法需要色谱纯化的额外步骤。
[背景 ] 蛋白质分子可通过常规实验进行定量酶联免疫吸附测定法，western印迹和质谱的方法，例如。这些常规的定量蛋白质谱分析技术涉及使用校准曲线进行相对测量，而没有考虑DNA扩增的高灵敏度，这限制了蛋白质本身绝对量的检测。化学蛋白质组学成为可能多重测定我n中的相对定量方式，例如串联质量标签标记方法加上质谱（汤普森等人，2003 ）。蛋白质条形码技术与下一代测序技术相结合已经可以识别目标蛋白质分子。这些方法包括CITE- SEQ ，的Ab- SEQ 和L1 BRA- SEQ ...
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