| Confocal Microscopy of Reovirus Transport in Living Dorsal Root Ganglion Neurons
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] Neurotropic reoviruses repurpose host machinery to traffic over long distances in neuronal processes and access distal replication sites. Understanding mechanisms of neuronal transmission is facilitated by using simplified in vitro primary neuronal culture models. Advances in the design of compartmentalized microfluidic devices lend robustness to neuronal culture models by enabling compartmentalization and manipulation of distinct neuronal processes. Here, we describe a streamlined methodology to culture sensory neurons dissociated from dorsal root ganglia of embryonic rats in microfluidic devices. We further describe protocols to exogenously label reovirus and image, track, and analyze transport of single reovirus particles in living neurons. These techniques can be adapted to study ...
[摘要] [摘要] 嗜神经性呼肠孤病毒重新利用宿主机器在神经元过程中进行长距离的传输，并进入远端复制部位。简化的体外原代神经元培养模型有助于理解神经元传递机制。室化微流控装置设计的进展使得不同的神经元过程能够被划分和操作，从而为神经元培养模型提供了稳健性。在这里，我们描述了一种在微流控装置中培养胚胎大鼠背根神经节分离的感觉神经元的方法。我们进一步描述了外源性标记呼肠孤病毒的方法，并对单个呼肠孤病毒粒子在活神经元中的转运进行了成像、跟踪和分析。这些技术可应用于研究其他嗜神经病毒的轴突定向转运以及参与信号传导和病理学的神经因子。
[背景]来自不同家族的病毒，包括黄病毒科、疱疹病毒科、小角RNA病毒科和弹状病毒科，突破神经系统的保护屏障，造成严重的疾病和经济负担（Koyuncu等人，2013年；Bohmwald等人，2018年；Tyler，2018年）。哺乳动物正呼肠孤病毒（reovirus，reovirus）属于呼肠孤病毒科，在多种年轻哺乳动物中引起血清型依赖性神经元感染，可导致致命性脑炎（Tyler等人，1986年；Dermody等人，2013年）。呼肠孤病毒没有被两个同心蛋白壳包裹的片段dsRNA基因组包裹，是研究神经系统病毒感染的一种灵活工具（Dermody等人，2013年）。虽然呼肠孤病毒感染的细胞和分子机制已被广泛地利用转化细胞系进行研究，但这些系统并不能捕捉到极化神经元细胞的复杂性。感染神经元的病毒必须在轴突中长距离传播，才能到达复制和释放的远端。为了了解呼肠孤病毒进入神经元和长距离运输的机制，我们最近采用了一些技术来培养原代神经元，并对活细胞中荧光标记的呼肠孤病毒成像（Aravamudhan等人，2020年）。 ...
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| Measuring Cell Growth and Junction Development in Epithelial Cells Using Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an automated method that can be used to quantify processes such as cell attachment, growth, migration and barrier functions (i.e., the properties of tight junctions). The method provides simultaneous information on cell number and tight junction function by detecting electric parameters of cells grown on electrodes. Samples are probed with small alternating current (AC) over a range of frequencies, and changes in capacitance and impedance are measured over time. Capacitance reflects the degree of electrode coverage by cells, that correlates with cell number, and can be used to assess cell proliferation or migration. Impedance values inform about barrier function. Obtaining real-time simultaneous information on these parameters ...
[摘要] [摘要 ] 电动细胞-基底阻抗感测（ECIS）是一个自动化的方法，该方法可用于定量如细胞附着，生长，迁移和屏障功能的处理（即， 紧密连接的特性）。该方法通过检测在电极上生长的细胞的电参数，提供有关细胞数量和紧密连接功能的同时信息。用小的交流电（AC）在一定频率范围内探测样品，并随时间测量电容和阻抗的变化。电容反映了细胞对电极的覆盖程度，与细胞数量相关，可用于评估细胞增殖或迁移。阻抗值告知屏障功能。获取有关这些参数的实时同步信息对于该系统而言是独一无二的，对于解决诸如紧密连接蛋白在细胞生长和迁移中的作用等基本问题具有重要价值。该协议描述了使用ECIS来跟踪肾小管上皮细胞中的细胞生长和紧密连接依赖性屏障生成。我们使用这种方法来探索如何耗尽紧密连接蛋白claudin-2如何影响肾小管细胞的生长和屏障功能。在此过程中，将细胞用对照或claudin-2特异性siRNA转染，然后在24小时后铺在电极上。随着单层细胞的发育，ECIS自动收集有关细胞生长和屏障的信息。最初使用ECIS软件对数据进行分析，然后将其导出到图形软件中以进行进一步处理。
[背景 ] 上皮细胞产生以成熟的细胞间连接为特征的单层细胞。来自连接的输入确定细胞行为，包括增殖和迁移。随着连接的发展，由于接触抑制，细胞增殖和迁移减慢，然后停止（McClatchey and ...
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