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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] The efficiency of cleavage of individual CRISPR/Cas9-sgRNAs remains difficult to predict based on the CRISPR target sequence alone. Different intracellular environments (dependent on cell type or cell cycle state for example) may affect sgRNA efficiency by altering accessibility of genomic DNA through DNA modifications such as epigenetic marks and DNA-binding proteins (e.g., histones) as well as alteration of the chromatin state of genomic DNA within the nucleus.
We recently reported a multi-step screening method for the identification of efficient sgRNAs targeting the Herpes simplex virus (HSV-1) genome and reported a differential mechanism for viral inhibition by CRISPR-Cas9 in the latent versus lytic phase. The screening platform detailed in this protocol allows ...
[摘要] [摘要 ] 单独基于CRISPR靶序列仍难以预测单个CRISPR / Cas9-sgRNA的切割效率。不同的细胞内环境（例如，取决于细胞类型或细胞周期状态）可能会通过DNA修饰（例如表观遗传标记和DNA结合蛋白（例如组蛋白））和染色质状态的改变来改变基因组DNA的可及性，从而影响sgRNA效率。核内基因组DNA的标记。
我们recen TLY 报道的多步骤方法筛选用于有效sgRNAs靶向的识别的单纯疱疹病毒（HSV-1）的基因组，并报告为在潜对裂解病毒相抑制CRISPR-Cas9的差动机构。该协议中详述的筛选平台允许在无细胞系统中以及在病毒靶细胞（例如人包皮成纤维细胞）的背景下逐步测试切割效率，然后对CRISPR / sgRNA的作用进行功能测试病毒蛋白的表达，复制，和再活化。该策略可以容易地应用于其他靶细胞，例如多能干细胞衍生的人感觉神经元或其他人DNA病毒。
背景 ] 单纯疱疹病毒（HSV）是的一种嗜神经性DNA病毒疱疹病毒科家族引起终身和无法治愈感染在大多数人群的，并可能导致显著发病率和死亡率（Liesegang环等人，1989; Roizman 等人。，2013） ...
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Cell-based functional assays are an important part of compound screening and drug lead optimization, and they can also play a crucial role in the determination of the residues involved in ligand binding and signaling for a particular G-protein-coupled receptor. Conventional methods used for Gαq/15-coupled receptors rely on the use of fluorescent probes for Ca++ sensing (such as Fura-2 and Fluo-4) or on the incorporation of [3H]-inositol into inositol 1,4,5- triphosphate (IP3). However, these methods are not suitable for screening large libraries of compounds or for screening several mutants of the same receptor. In contrast, the IP-One assay by Cisbio is a TR-FRET assay suitable for large compound library screening when using stable cell lines that express ...
[摘要] [摘要 ] 基于细胞的功能测定法是化合物筛选和药物先导物优化的重要组成部分，并且它们可以也参与配体结合和信令残留量的测定起到至关重要的作用为一个特定的G蛋白偶联受体。用于Gα常规方法的q / 15 -偶联受体依赖于使用用于钙荧光探针++ 感测（如的Fura-2和的Fluo-4）或上掺入[的3 H] - 肌醇成肌醇1,4- ，5-三磷酸（IP3）。然而，这些方法不适合用于筛选大文库的化合物或用于筛选相同的受体的几个突变体。相反，IP-一个测定由Cisbio公司是TR-FRET测定适合大型化合物文库使用的稳定细胞株的筛选时，表达一个特定7TMR 。但是，当使用瞬时转染的7TMR突变体时，此检测方法并不理想，因为它需要两步操作进行细胞培养。因此，我们已经优化了IP-One的测定使用协议的在384孔反向转染方法的板。这为先前用于筛选Gαq / 15 偶联7TMR 的几种突变体的两步法提供了一种省时和省资源的替代方案。
[背景 ] 七跨膜受体（7TMR），也被称为G蛋白偶联受体，是超家族参与信号转导的最重要的跨膜蛋白。它们是临床批准药物的30％至50％的目标（Overington 等，2006）。Gαq / 15 偶联的7TMR激活磷脂酶Cβ（PLCβ），并产生D-肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3触发细胞内Ca ++ ...
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