| Novel Protein-oligonucleotide Conjugation Method Involving a High-affinity Capture HaloTag
|
|
Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Highly sensitive quantitative protein profiling can play a key role in the early diagnosis of diseases, such as autoimmune diseases and cancer. We developed a modified protein-oligonucleotide conjugation method termed HaloTag-mediated barcoding, for quantifying protein molecules at a higher sensitivity than conventional protein quantification methods. This novel and efficient conjugation method can be used to prepare HaloTag-barcoded proteins using a click chemistry-based labeling technique. Here, we describe the preparation of protein-DNA complexes and detection of protein-protein interactions which can be used in a HaloTag protein barcode assay to detect an antibody. The protocol includes procedures for preparing the ligand-oligonucleotide complex, plasmid DNA preparation for protein ...
[摘要] [摘要 ] 高灵敏度的定量蛋白质谱分析可以在疾病的早期诊断中发挥关键作用，例如自身免疫性疾病和癌症。我们开发了一种改良的蛋白质-寡核苷酸缀合方法，称为HaloTag 介导的条形码，用于以比常规蛋白质定量方法更高的灵敏度来定量蛋白质分子。可以使用这种基于点击化学的标记技术，将这种新颖而有效的结合方法用于制备HaloTag 条形码蛋白。在这里，我们描述了可在HaloTag中使用的蛋白质-DNA复合物的制备和蛋白质-蛋白质相互作用的检测 蛋白质条形码检测以检测抗体。该方案包括制备配体-寡核苷酸复合物的程序，用于蛋白质表达的质粒DNA制备以及蛋白质-寡核苷酸复合物的制备。所描述的基于点击反应的方案简化了常规胺-酯反应方法，该方法需要色谱纯化的额外步骤。
[背景 ] 蛋白质分子可通过常规实验进行定量酶联免疫吸附测定法，western印迹和质谱的方法，例如。这些常规的定量蛋白质谱分析技术涉及使用校准曲线进行相对测量，而没有考虑DNA扩增的高灵敏度，这限制了蛋白质本身绝对量的检测。化学蛋白质组学成为可能多重测定我n中的相对定量方式，例如串联质量标签标记方法加上质谱（汤普森等人，2003 ）。蛋白质条形码技术与下一代测序技术相结合已经可以识别目标蛋白质分子。这些方法包括CITE- SEQ ，的Ab- SEQ 和L1 BRA- SEQ ...
|
|
|
| Mapping mRNA-18S rRNA Contacts Within Translation Initation Complex by Means of Reverse Transcriptase Termination Sites and RNAseq
|
|
Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] The nucleotides involved in RNA-RNA interaction can be tagged by chemical- or UV-induced crosslinking, and further identified by classical or modern high throughput techniques. The contacts of mRNA with 18S rRNA that occur along the mRNA channel of 40S subunit have been mapped by site-specific UV crosslinking followed by reverse transcriptase termination sites (RTTS) using radioactive or fluorescent oligonucleotides. However, the sensitivity of this technique is restricted to the detection of those fragments that resulted from the most frequent crosslinkings. Here, we combined RTTS with RNAseq to map the mRNA-18S rRNA contacts with a much deeper resolution. Although aimed to detect the interaction of mRNA with the ES6S region of 18S rRNA, this technique can also be applied to map the ...
[摘要] [摘要 ] 可以通过化学或紫外线诱导的交联来标记参与RNA-RNA相互作用的核苷酸，并通过经典或现代的高通量技术对其进行进一步鉴定。沿着40S亚基的mRNA通道发生的18S rRNA与mRNA的接触已通过位点特异性UV交联进行了定位，随后使用放射性或荧光寡核苷酸进行了逆转录酶终止位点（RTTS）。但是，该技术的敏感性仅限于检测由最频繁的交联产生的那些片段。在这里，我们将RTTS与RNAseq结合使用，以更深的分辨率绘制了mRNA-18S rRNA接触图。尽管旨在检测mRNA与18S rRNA的ES6S区域的相互作用，但该技术也可以用于绘制mRNA与其他非编码RNA分子的相互作用（在转录，剪接或RNA介导的转录后调控过程中（例如，snRNA，microRNA和lncRNA）。
[背景 ] 是与非编码RNA的mRNA的相互作用volved mRNA中的生命周期的每个步骤，从它的生物合成和处理进入细胞核至细胞质中的翻译和最终降解。这些相互作用可以在大分子机器核糖体和剪接体，以及在较小的复合物如RISC或者发生（RNA诱导的沉默复合物）或lncRNA介导的基因表达调节期间（皮萨列夫等人，2008; Engreitz 。等人，2014 Sharma ...
|
|
|