| Confocal Microscopy of Reovirus Transport in Living Dorsal Root Ganglion Neurons
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] Neurotropic reoviruses repurpose host machinery to traffic over long distances in neuronal processes and access distal replication sites. Understanding mechanisms of neuronal transmission is facilitated by using simplified in vitro primary neuronal culture models. Advances in the design of compartmentalized microfluidic devices lend robustness to neuronal culture models by enabling compartmentalization and manipulation of distinct neuronal processes. Here, we describe a streamlined methodology to culture sensory neurons dissociated from dorsal root ganglia of embryonic rats in microfluidic devices. We further describe protocols to exogenously label reovirus and image, track, and analyze transport of single reovirus particles in living neurons. These techniques can be adapted to study ...
[摘要] [摘要] 嗜神经性呼肠孤病毒重新利用宿主机器在神经元过程中进行长距离的传输，并进入远端复制部位。简化的体外原代神经元培养模型有助于理解神经元传递机制。室化微流控装置设计的进展使得不同的神经元过程能够被划分和操作，从而为神经元培养模型提供了稳健性。在这里，我们描述了一种在微流控装置中培养胚胎大鼠背根神经节分离的感觉神经元的方法。我们进一步描述了外源性标记呼肠孤病毒的方法，并对单个呼肠孤病毒粒子在活神经元中的转运进行了成像、跟踪和分析。这些技术可应用于研究其他嗜神经病毒的轴突定向转运以及参与信号传导和病理学的神经因子。
[背景]来自不同家族的病毒，包括黄病毒科、疱疹病毒科、小角RNA病毒科和弹状病毒科，突破神经系统的保护屏障，造成严重的疾病和经济负担（Koyuncu等人，2013年；Bohmwald等人，2018年；Tyler，2018年）。哺乳动物正呼肠孤病毒（reovirus，reovirus）属于呼肠孤病毒科，在多种年轻哺乳动物中引起血清型依赖性神经元感染，可导致致命性脑炎（Tyler等人，1986年；Dermody等人，2013年）。呼肠孤病毒没有被两个同心蛋白壳包裹的片段dsRNA基因组包裹，是研究神经系统病毒感染的一种灵活工具（Dermody等人，2013年）。虽然呼肠孤病毒感染的细胞和分子机制已被广泛地利用转化细胞系进行研究，但这些系统并不能捕捉到极化神经元细胞的复杂性。感染神经元的病毒必须在轴突中长距离传播，才能到达复制和释放的远端。为了了解呼肠孤病毒进入神经元和长距离运输的机制，我们最近采用了一些技术来培养原代神经元，并对活细胞中荧光标记的呼肠孤病毒成像（Aravamudhan等人，2020年）。 ...
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| Analyzing (Re)Capping of mRNA Using Transcript Specific 5' End Sequencing
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] The 5′ cap is a ubiquitous feature of eukaryotic mRNAs. It is added in the nucleus onto newly synthesized pre-mRNA, and in the cytoplasm onto mRNAs after decapping or endonuclease cleavage. Cytoplasmic recapping can occur after loss of the cap at the native 5′ end, or downstream within the body of the mRNA. The identification and location of recapping events is key to understanding the functional consequences of this process. Here we present an approach that addresses this problem, using the Lexogen TeloPrime® cDNA synthesis kit to tag recapped 5′ ends. TeloPrime uses a proprietary DNA ligase to add a double stranded DNA oligonucleotide onto the 3′ end of cDNA while it is base paired with mRNA. Specificity for capped ends is obtained by the oligonucleotide having an unpaired C ...
[摘要] [摘要]5′cap是真核mRNAs普遍存在的特征。它被添加到新合成的pre-mRNA的细胞核中，并在去盖或核酸内切酶切割后加入到mRNAs的细胞质中。细胞质重拾可发生在5′端或mRNA体下游的cap缺失后。识别和定位重述事件是理解该过程的功能后果的关键。这里我们提出了一种解决这个问题的方法，使用Lexogen TeloPrime®cDNA合成试剂盒来标记重述的5′端。TeloPrime使用一种专有的DNA连接酶，在cDNA的3′端加入一个双链DNA寡核苷酸，同时与mRNA碱基配对。寡核苷酸在mRNA 5′端有一个与m7G弱碱基配对的不成对C残基。然后用引物对附加的寡核苷酸和感兴趣的mRNA进行双链cDNA的PCR扩增。得到的产物是凝胶纯化和直接测序（如果是单个带）或克隆和测序。连接的寡核苷酸和靶mRNA连接处的序列提供了cap在相应转录物上的位置。此方法适用于所有封顶转录本。它可以与Sanger测序一起用于少量的转录物，也可以用于Illumina库测序。
[背景]N7-甲基鸟苷帽是所有真核mRNAs的一个显著特征。与cap结合的蛋白质在mRNA生命周期的各个阶段发挥作用，包括核加工、输出、翻译和mRNA衰变。5′cap以共转录方式添加到所有mRNAs中，并开发了许多全基因组技术（例如，基因表达的Capped分析，或CAGE）（Morioka等人，2020年），这些技术利用末端末端的鉴定来标记转录起始位点。除了标记转录起始位点外，约25%的笼状标签映射到剪接内含子的下游（Djebali等人，2012年）。生物化学基础的证据来自我们实验室2009年的鉴定：一种细胞质复合体能够将N7甲基鸟苷帽恢复到5′-单磷酸末端的转录物上，但不能恢复到5′-羟基末端的转录物上（Otsuka等人，2009年）。细胞质封顶由一种复合酶催化，包括封盖酶（RNGTT）、帽甲基转移酶（RNMT）及其激活亚单位（RAM），以及一种将去盖转录物的5′-单磷酸末端转化为5′-二磷酸底物以进行GMP添加的激酶（Trotman和Schoenberg，2019）。我们的早期工作是基于在GMP添加步骤中阻断细胞质封盖的显性负型封盖酶的使用。该蛋白的表达导致出现许多未封顶的转录本，其末端使用5'-种族定位到下游笼状标签附近（Kiss等人，2015年；Berger等人，2019年）。虽然令人鼓舞，但这种方法有三个主要缺点：a）它需要分离带帽和未封顶的rna，b）它假设未封顶的转录本保持足够稳定，可以被检测到，以及c）它假设以这种方式检测到的未封顶末端经历了有限的额外的核外溶核修剪。 ...
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