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Date:
2021-04-05
[Abstract] Secondary active transporters reside in cell membranes transporting polar solutes like amino acids against steep concentration gradients, using electrochemical gradients of ions as energy sources. Commonly, ensemble-based measurements of radiolabeled substrate uptakes or transport currents inform on kinetic parameters of transporters. Here we describe a fluorescence-based functional assay for glutamate and aspartate transporters that provides single-transporter, single-transport cycle resolution using an archaeal elevator-type sodium and aspartate symporter GltPh as a model system. We prepare proteo-liposomes containing reconstituted purified GltPh transporters and an encapsulated periplasmic glutamate/aspartate-binding protein, PEB1a, labeled with donor and acceptor fluorophores. We then ...
[摘要] [摘要]次级活性转运蛋白驻留在细胞膜中，利用离子的电化学梯度作为能量源，可针对陡峭的浓度梯度转运极性氨基酸（如氨基酸）。通常，基于集合的放射性标记底物摄取或转运电流的测量可确定转运蛋白的动力学参数。在这里，我们描述了一种基于荧光的谷氨酸和天冬氨酸转运蛋白功能测定方法，该方法使用古细菌升降剂型钠和天冬氨酸共转运蛋白Glt Ph作为模型系统，提供了单转运蛋白，单转运周期的分辨率。我们准备包含重组的纯化的Glt Ph转运蛋白和封装的周质谷氨酸/天冬氨酸结合蛋白，PEB1a，用供体和受体荧光团标记的蛋白脂质体。然后，我们将蛋白脂质体表面固定化，并使用单分子全内反射荧光（TIRF）显微镜测量随时间变化的运输依赖性荧光共振能量转移（FRET）效率变化。与放射性配体摄取测定法相比，该测定法在时间分辨率上提高了10-100倍。它还可以对不同转运周期步骤进行动力学表征，并识别转运蛋白种群内的动力学异质性。
[背景]膜驻留的二级主动转运蛋白或溶质载体（SLC）介导氨基酸，激素，神经递质，维生素和药物等溶质的细胞摄取。他们将集中的底物摄取与主要通过Na + / K + ATPases的作用维持的离子电化学梯度的能量上有利的耗散结合在一起（Lingrel and Kuntzweiler ...
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