| Generation and Implementation of Reporter BHK-21 Cells for Live Imaging of Flavivirus Infection
|
|
Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] The genus Flavivirus within the family Flaviviridae includes many viral species of medical importance, such as yellow fever virus (YFV), Zika virus (ZIKV), and dengue virus (DENV), among others. Presently, the identification of flavivirus-infected cells is based on either the immunolabeling of viral proteins, the application of recombinant reporter replicons and viral genomes, or the use of cell-based molecular reporters of the flaviviral protease NS2B-NS3 activity. Among the latter, our flavivirus-activatable GFP and mNeptune reporters contain a quenching peptide (QP) joined to the fluorescent protein by a linker consisting of a cleavage site for the flavivirus NS2B-NS3 proteases (AAQRRGRIG). When the viral protease cleaves the linker, the quenching peptide is removed, and the ...
[摘要] [摘要]本属黄病毒家族中的黄病毒包括医学重要性许多病毒种类，如黄热病病毒（YFV），寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV），等等。目前，黄病毒感染细胞的鉴定是基于病毒蛋白的免疫标记，重组报告子复制子和病毒基因组的应用，或黄病毒蛋白酶NS2B-NS3活性的基于细胞的分子报告子的使用。在后者中，我们的黄病毒可激活的GFP和mNeptune报道分子含有通过接头连接到荧光蛋白的淬灭肽（QP），该接头由黄病毒NS2B - NS3蛋白酶（AAQRRGRIG）的切割位点组成。当病毒蛋白酶切割接头时，淬灭肽被去除，并且荧光蛋白采用促进荧光的构象。在这里，我们提供了用于表达，选择和实施表达黄病毒基因编码分子报告子的稳定BHK-21细胞的详细协议，适用于通过活细胞成像监测病毒感染。我们还将描述图像分析过程并提供所需的软件管道。我们的报告细胞允许通过活细胞成像对黄病毒的参考菌株和天然菌株实施单细胞感染动力学以及噬菌斑测定。
图形摘要：
黄病毒感染实时成像的报告基因BHK-21细胞的产生与实施工作流。
[背景]黄病毒代表了正在引起并正在重新出现的全球性威胁，可能引起动物和人类疾病，包括许多与医学有关的病毒，例如黄热病病毒（YFV），西尼罗河病毒（WNV），日本脑炎病毒（JEV），登革热病毒（DENV），并兹卡六RUS（ZIKV），等等（摹·乌尔德·所罗门，2008） ...
|
|
|
| Determination of Antibacterial Activity of Film Coatings against Four Clinically Relevant Bacterial Strains
|
|
Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Antibacterial coatings have currently gained great importance in biomedical technology investigations. Because of the spatial arrangement of the film coatings, evaluation of antibacterial activity presents a new challenge regarding traditional bacterial counting methods. In this protocol, four clinically relevant pathogens, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus were incubated on titania mesostructured thin film coatings for 24 h. Then, cell viability was studied considering three methods: counting of the number of colony forming units (CFU), live/dead staining, and quantification of extracellular DNA in suspension. Firstly, bacterial count was determined by the standard plate-count technique. Secondly, bacteria membrane integrity was ...
[摘要] [摘要]抗菌涂料目前在生物医学技术研究中具有重要意义。由于薄膜包衣的空间排列，抗菌活性的评估对传统的细菌计数方法提出了新的挑战。在此协议中，将四种临床相关病原体，鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌在二氧化钛介孔薄膜涂层上孵育24小时。然后，考虑三种方法研究细胞生存力：计数菌落形成单位（CFU）的数量，活/死染色以及悬浮液中细胞外DNA的定量。首先，通过标准的盘数技术确定细菌数。其次，通过利用两种荧光染料评估细菌膜的完整性，这两种荧光染料可以区分活细菌（完整的膜）和死细菌（破膜的）。最后，通过分光光度法定量细胞外DNA 。以这种方式，上述三种技术使得能够通过定性和定量分析研究细菌的生存力。
[背景]功能性涂料，由于他们提供的材料工程领域的宝贵优势被广泛研究。它们能够引入新的表面特性，而不会改变材料的体积特性。在它们的功能中，抗菌涂层对于生物医学应用已显示出极大的重要性（Mateescu等人，2015）。从这个意义上讲，纳米技术提供了制造抗菌涂层的重要工具。我们的小组已经实现了具有广谱杀菌活性的纳米结构涂层的合成，而没有利用抗生素或排斥细菌的物质（Scilletta et al。，2019）。在这里，只有个êSUP ...
|
|
|
| A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
|
|
Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The assay takes advantage of the well-known retrograde trafficking of cholera toxin engineered with split-fluorescent proteins to generate novel tools for immediate monitoring of intracellular trafficking. ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化，因此是一个关键的分选步骤。然而，有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里，我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性，利用裂解荧光蛋白产生了新的工具，用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础，以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力，以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络（TGN）。在从分选内体产生的其他贩运途径中，通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤（Johannes和Popoff，2008）。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网（ER）的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成，并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病（Cho等人，2012年；Personnic等人，2016年；Williams和Tsai，2016年）。
...
|
|
|