| Plant ARGONAUTE Protein Immunopurification for Pathogen Cross Kingdom Small RNA Analysis
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Over the last decade, it has been noticed that microbial pathogens and pests deliver small RNA (sRNA) effectors into their host plants to manipulate plant physiology and immunity for infection, known as cross kingdom RNA interference. In this process, fungal and oomycete parasite sRNAs hijack the plant ARGONAUTE (AGO)/RNA-induced silencing complex to post-transcriptionally silence host target genes. We hereby describe the methodological details of how we recovered cross kingdom sRNA effectors of the oomycete pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis during infection of its host plant Arabidopsis thaliana. This Bio-protocol contains two parts: first, a detailed description on the procedure of plant AGO/sRNA co-immunopurification and sRNA recovery for Illumina high throughput sequencing ...
[摘要] [摘要]在过去的十年中，已经注意到，微生物病原体和害虫将小RNA（sRNA）效应子传递到宿主植物中，以操纵植物生理学和免疫力，称为跨界RNA干扰。在此过程中，真菌和卵菌寄生虫sRNA劫持了植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合体，以转录后沉默宿主靶基因。我们在此描述方法学的细节，我们如何在宿主植物拟南芥感染期间恢复卵菌病原体拟南芥的跨界sRNA效应子。该生物协议包含两个部分：第一，关于植物AGO / sRNA co- 免疫纯化和sRNA回收，用于Illumina高通量测序分析。其次，我们解释了如何进行生物信息学小号斯尔纳序列分析读取可使用Galaxy服务器。原则上，该协议适用于研究来自多种宿主植物和植物相互作用（微生物）的AGO结合的sRNA。
[背景]小RNA（sRNA）可以充当病原体效应物，劫持植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合物（RISC），并使宿主mRNA沉默以进行感染，这种病毒被称为跨界RNA干扰的毒力机制（Weiberg等。，2015； Zeng等，2019）。分析感染期间与植物AGO结合的sRNA的库是一种选择方法，以全面了解可能通过宿主AGO / RISC起作用的植物入侵性病原体sRNA。基于抗体的植物AGO / ...
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| Expression and Purification of Functionally Active Serotonin 5-HT2A Receptor in Insect Cells Using Low-titer Viral Stock
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Date:
2020-08-05
[Abstract] The serotonin 5-HT2A receptor (5-HT2AR) is a member of the GPCR family that is important for various neurological functions and whose dysregulation causes many mental health disorders. Structural investigations of 5-HT2AR require the production of functionally active receptors expressed from eukaryotic cell cultures. In this protocol, we describe a step-by-step method to express and purify serotonin 5-HT2AR using a baculoviral expression vector system in Sf9 cell cultures, derived from our work with the rat (matching Uniprot ID P14842) and human (matching Uniprot ID P28223) 5-HT2ARs. A unique feature of this method is the utilization of cell culture additives to infect cells at low multiplicity of infection, thereby using several fold ...
[摘要] [摘要] 血清素5-HT2A受体（5-HT2AR）是GPCR家族的一员，对多种神经功能起重要作用，其调节失调会导致许多心理健康障碍。5-HT2AR的结构研究需要从真核细胞培养物中产生功能活性受体。在本方案中，我们描述了一种在Sf9细胞培养中使用杆状病毒表达载体系统表达和纯化血清素5-HT2AR的分步方法，该方法来源于我们对大鼠（匹配Uniprot ID P14842）和人类（匹配Uniprot ID P28223）5-HT2AR的研究。这种方法的一个独特的特点是使用细胞培养添加剂以低感染倍数感染细胞，从而使用比不使用添加剂的先前方法少几倍的病毒滴度。该方案可以通过改变感染后收获时间来选择性地过度表达糖基化或非糖基化形式的受体。
[背景]在过去十年中，由于功能活性受体高产表达方法的发展，对GPCRs的结构研究激增（Granier和Kobilka，2012）。其中，5-羟色胺GPCRs是一组小而多样的受体，在神经调节中起着重要作用，它们的功能障碍与许多心理健康障碍有关（Berger等人，2009）。在利用真核宿主进行蛋白质表达的多种方法中，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，利用Sf9细胞结合杆状病毒表达系统表达GPCRs因其高产率和可靠性而成为一个突出的方法（Saarenpaa等人，2015年；Wiseman等人，2020年）。然而，各种方法不断发展，以克服现有方法的各种缺点。目前还没有一种统一的、单一的方法来表达所有类型的GPCRs，并没有足够高的产率来进行结构研究。这在一定程度上是由于这些受体的多样性，以及它们的序列需要修改，以使晶体学研究成为可能。单电子显微镜的出现对电子显微镜的研究提出了更高的要求。利用昆虫细胞中杆状病毒表达的现有方法的一个关键要求是获得高滴度的病毒储备，这在许多情况下是非常重要的。此外，对于蛋白质的生产，感染细胞通常在感染的多样性~1-5，需要使用大量的病毒滴度，而病毒滴度会随着时间的推移而耗尽。使用多个批次的病毒滴度可以增加批次间的变异性。因此，强烈需要消耗更少病毒滴度的方法。此外，许多GPCRs的天然形式，包括5-羟色胺受体，具有广泛的糖基化，这不是所有情况下都需要的。因此，任何能够提供主要糖基化或非糖基化形式受体的方法，优选地通过简单改变方案，也是可取的。在这里，我们描述了一种在Sf9细胞中使用杆状病毒表达系统表达和纯化5-HT2AR的方法，与现有方法相比，该方法需要最少的病毒滴度，并且可以通过改变感染后收获时间来选择糖基化程度。该方案基于先前的工作（Wacker等人，2013；Mahesh等人，2018；Mozumder等人，2020），已经标准化，以制备用于高分辨率低温组织结构测定的样品，并且适用于采用类似表达和纯化策略的其他GPCR、膜蛋白和其他可溶性蛋白质。 ...
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