| Total Triglyceride Quantification in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] Several studies suggest an important role of lipid metabolism in regulating longevity of Caenorhabditis elegans. Therefore, assays to quantify lipids have enormous value in understanding aging and pathologies associated with it. Approximately 70% of lipid metabolism genes in the nematode have orthologs in humans. Amenability of C. elegans to genetic manipulations has allowed investigations into the role of specific genetic factors in lipid metabolism. Here, we describe a protocol to quantify total triglycerides in C. elegans, which can be extended to studies of the effects of altered environmental and genetic factors on stored fats. This protocol quantifies the picomoles of the triglycerides, in whole worm lysate. Due to the sensitivity of the assay, it could ...
[摘要] [摘要]多项研究表明脂质代谢在调节秀丽隐杆线虫的寿命中具有重要作用。因此，定量脂质的测定在理解衰老和与其相关的病理学方面具有巨大价值。线虫中大约70％的脂质代谢基因在人类中具有直系同源物。秀丽隐杆线虫对基因操作的适应性允许调查特定遗传因素在脂质代谢中的作用。在这里，我们描述了一个协议，以定量总甘油三酯在秀丽隐杆线虫，这CA n可以扩展到环境和遗传因素改变对储存脂肪的影响的研究。该协议量化了整个蠕虫裂解物中甘油三酸酯的皮摩尔。由于测定的敏感性，它可以帮助鉴定总存储脂肪的细微变化，这是显微镜技术无法识别的。
[背景]多余的卡路里通常以三酰基甘油或糖原的形式存储（Cohen，2018年）。甘油三酸酯（TAGs）的异常水平与人类的心脏病，胰腺炎和动脉粥样硬化有关（Cameron等人，1974; Lee等人，2003; Walther和Farese，2012; Onal等人，2017）。TAG被包装到细胞质中的脂滴中。脂质液滴存在于真核细胞中，大小从20 nm到100 µm不等（Stobart等，1986； ...
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| Expression and Purification of Functionally Active Serotonin 5-HT2A Receptor in Insect Cells Using Low-titer Viral Stock
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The serotonin 5-HT2A receptor (5-HT2AR) is a member of the GPCR family that is important for various neurological functions and whose dysregulation causes many mental health disorders. Structural investigations of 5-HT2AR require the production of functionally active receptors expressed from eukaryotic cell cultures. In this protocol, we describe a step-by-step method to express and purify serotonin 5-HT2AR using a baculoviral expression vector system in Sf9 cell cultures, derived from our work with the rat (matching Uniprot ID P14842) and human (matching Uniprot ID P28223) 5-HT2ARs. A unique feature of this method is the utilization of cell culture additives to infect cells at low multiplicity of infection, thereby using several fold ...
[摘要] [摘要] 血清素5-HT2A受体（5-HT2AR）是GPCR家族的一员，对多种神经功能起重要作用，其调节失调会导致许多心理健康障碍。5-HT2AR的结构研究需要从真核细胞培养物中产生功能活性受体。在本方案中，我们描述了一种在Sf9细胞培养中使用杆状病毒表达载体系统表达和纯化血清素5-HT2AR的分步方法，该方法来源于我们对大鼠（匹配Uniprot ID P14842）和人类（匹配Uniprot ID P28223）5-HT2AR的研究。这种方法的一个独特的特点是使用细胞培养添加剂以低感染倍数感染细胞，从而使用比不使用添加剂的先前方法少几倍的病毒滴度。该方案可以通过改变感染后收获时间来选择性地过度表达糖基化或非糖基化形式的受体。
[背景]在过去十年中，由于功能活性受体高产表达方法的发展，对GPCRs的结构研究激增（Granier和Kobilka，2012）。其中，5-羟色胺GPCRs是一组小而多样的受体，在神经调节中起着重要作用，它们的功能障碍与许多心理健康障碍有关（Berger等人，2009）。在利用真核宿主进行蛋白质表达的多种方法中，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，利用Sf9细胞结合杆状病毒表达系统表达GPCRs因其高产率和可靠性而成为一个突出的方法（Saarenpaa等人，2015年；Wiseman等人，2020年）。然而，各种方法不断发展，以克服现有方法的各种缺点。目前还没有一种统一的、单一的方法来表达所有类型的GPCRs，并没有足够高的产率来进行结构研究。这在一定程度上是由于这些受体的多样性，以及它们的序列需要修改，以使晶体学研究成为可能。单电子显微镜的出现对电子显微镜的研究提出了更高的要求。利用昆虫细胞中杆状病毒表达的现有方法的一个关键要求是获得高滴度的病毒储备，这在许多情况下是非常重要的。此外，对于蛋白质的生产，感染细胞通常在感染的多样性~1-5，需要使用大量的病毒滴度，而病毒滴度会随着时间的推移而耗尽。使用多个批次的病毒滴度可以增加批次间的变异性。因此，强烈需要消耗更少病毒滴度的方法。此外，许多GPCRs的天然形式，包括5-羟色胺受体，具有广泛的糖基化，这不是所有情况下都需要的。因此，任何能够提供主要糖基化或非糖基化形式受体的方法，优选地通过简单改变方案，也是可取的。在这里，我们描述了一种在Sf9细胞中使用杆状病毒表达系统表达和纯化5-HT2AR的方法，与现有方法相比，该方法需要最少的病毒滴度，并且可以通过改变感染后收获时间来选择糖基化程度。该方案基于先前的工作（Wacker等人，2013；Mahesh等人，2018；Mozumder等人，2020），已经标准化，以制备用于高分辨率低温组织结构测定的样品，并且适用于采用类似表达和纯化策略的其他GPCR、膜蛋白和其他可溶性蛋白质。 ...
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