| An Imaging Flow Cytometry Method to Measure Citrullination of H4 Histone as a Read-out for Neutrophil Extracellular Traps Formation
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Author:
Date:
2021-02-20
[Abstract] The formation of neutrophil extracellular traps (NETs) is thought to play a critical role in infections and propagating sterile inflammation. Histone citrullination is an essential and early step in NETs formation, detectable prior to the formation of the hallmark extracellular DNA-scaffolded strands. In addition to the classical microscopy method, new technologies are being developed for studies of NETs and their detection, both for research and clinical purposes. Classical microscopy studies of NETs are subjective, low throughput and semi-quantitative, and limited in their ability to capture the early steps. We have developed this novel Imaging Flow Cytometry (IFC) method that specifically identifies and quantifies citrullination of histone H4 as a NETs marker and its relationship with ...
[摘要] [摘要]中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成被认为在感染和传播无菌炎症中起关键作用。组蛋白瓜氨酸化是NETs形成中必不可少的早期步骤，可在形成标志性的细胞外DNA支架链之前检测到。除了经典的显微镜方法外，还在研究和临床目的开发用于NETs及其检测的新技术。NET的经典显微镜研究具有主观性，低通量和半定量性，并且捕获早期步骤的能力有限。我们开发了这种新颖的成像流式细胞仪 （IFC）方法，专门识别和量化组蛋白H4的瓜氨酸化作为NETs标记及其与核和细胞水平其他改变的关系。这些包括核解聚和超缩合，多分叶状核与1-叶核和细胞膜损伤。在形成特定的细胞外DNA支架链之前，可以在用NETs诱导剂进行不同的治疗期后对NETs标记物进行定量。由于这些高通量基于图像的细胞分析功能可以通过严格的统计来执行，因此该协议适用于实验和临床应用以及作为生物标志物的NETosis的临床评估。
[背景]活化的中性粒细胞迅速募集到感染和受伤的地方；它们有助于宿主抵抗病原体和炎症。大约在二十年前，首次观察到对病原体的反应是，一部分中性粒细胞会经历细胞凋亡或坏死以外的不同类型的细胞死亡。这涉及染色质的早期缩合，核区室和颗粒区室的共定位，最后将这种混合物释放到环境中。锚定核成分（例如组蛋白）或细胞成分的细胞外DNA支架链，其中一些具有很强的抗病原特性，例如弹性蛋白酶或髓过氧化物酶（MPO），被称为“嗜中性细胞外陷阱”或NETs，并具有有效的抗菌活性（Brinkmann等人，2004）。最近的证据表明，母语也非感染性疾病，包括癌症，系统性关联红斑狼疮，镰状细胞病，动脉粥样硬化和血栓形成（Jorch和Kubes，2017年）。尚不清楚NETs或其任何成分（无细胞DNA或组蛋白）是否作为驱动因素导致了这些疾病的病理，或者它们是否是免疫反应失衡的副产物。NETs在某些疾病中也可能充当生物标志物，并提供有关治疗方案功效的信息（Barnado等，2016）。NETs相关成分（例如弹性蛋白酶或MPO）存在于自身免疫性疾病患者的血浆中，也存在于感染中，这使这些分子作为生物标记物的特异性变得复杂。因此，迫切需要用于NETs表征的新方法，这些方法应在研究之间提供一致的标准，并且对于机械和临床应用均可靠。 ...
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| Flow Cytometry of CD14, VDR, Cyp27 and Cyp24 and TLR4 in U937 Cells
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] Chronic Kidney Disease (CKD) patients present a micro inflammation state due to failure renal function. The calcitriol has been described as an anti-inflammatory factor that might modulates the inflammatory response in CKD patients. However, these patients have deficiency of Calcitriol due to failure renal function. But, synthesis of this vitamin has been reported in extra renal production, as in monocytes. In this context, it has been reported that the supplementation with 25 vitamin D (calcidiol or inactive form of vitamin D) induces monocytes to downregulate inflammation, due to the intracellular 1α-hidroxilase that converts calcidiol to calcitriol in these cells. Besides some reports used RT-qPCR, Western Blot or immunofluorescence techniques to investigate the expression of ...
[摘要] [摘要] 慢性肾脏病（CKD）患者由于肾功能衰竭而出现微炎症状态。骨化三醇被认为是一种抗炎因子，可能调节CKD患者的炎症反应。然而，这些患者由于肾功能衰竭而出现骨化三醇缺乏症。但是，据报道，这种维生素的合成是在肾外产生的，比如在单核细胞中。在这种情况下，有报道称，补充25维生素D（钙二醇或不活跃形式的维生素D）可诱导单核细胞下调炎症反应，这是由于细胞内的1α-羟脯氨酸酶将钙二醇转化为骨化三醇。本研究除采用RT-qPCR、Western-Blot或免疫荧光技术研究炎症和维生素D机械生物标志物在几种疾病中的表达外，本研究还应用流式细胞术技术评价25种维生素D对CD14、Toll样受体4（TLR4）、维生素D受体（VDR）的影响，单核细胞系（U937）中的1-α羟化酶（CYP27）、24-羟化酶（CYP24）。将U937培养物与健康或CKD血清孵育，用或不加25维生素D（50 ng/ml，24 h）处理，以评估CD14、TRL4、VDR、CYP27和CYP24的表达。该方案显示了研究25维生素D处理对细胞内和细胞膜生物标志物表达的影响的优势。此外，与RT-qPCR、westernblot或免疫荧光法相比，该技术不费力，但易于操作和解释。
[背景] ...
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