| An Imaging Flow Cytometry Method to Measure Citrullination of H4 Histone as a Read-out for Neutrophil Extracellular Traps Formation
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Author:
Date:
2021-02-20
[Abstract] The formation of neutrophil extracellular traps (NETs) is thought to play a critical role in infections and propagating sterile inflammation. Histone citrullination is an essential and early step in NETs formation, detectable prior to the formation of the hallmark extracellular DNA-scaffolded strands. In addition to the classical microscopy method, new technologies are being developed for studies of NETs and their detection, both for research and clinical purposes. Classical microscopy studies of NETs are subjective, low throughput and semi-quantitative, and limited in their ability to capture the early steps. We have developed this novel Imaging Flow Cytometry (IFC) method that specifically identifies and quantifies citrullination of histone H4 as a NETs marker and its relationship with ...
[摘要] [摘要]中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成被认为在感染和传播无菌炎症中起关键作用。组蛋白瓜氨酸化是NETs形成中必不可少的早期步骤，可在形成标志性的细胞外DNA支架链之前检测到。除了经典的显微镜方法外，还在研究和临床目的开发用于NETs及其检测的新技术。NET的经典显微镜研究具有主观性，低通量和半定量性，并且捕获早期步骤的能力有限。我们开发了这种新颖的成像流式细胞仪 （IFC）方法，专门识别和量化组蛋白H4的瓜氨酸化作为NETs标记及其与核和细胞水平其他改变的关系。这些包括核解聚和超缩合，多分叶状核与1-叶核和细胞膜损伤。在形成特定的细胞外DNA支架链之前，可以在用NETs诱导剂进行不同的治疗期后对NETs标记物进行定量。由于这些高通量基于图像的细胞分析功能可以通过严格的统计来执行，因此该协议适用于实验和临床应用以及作为生物标志物的NETosis的临床评估。
[背景]活化的中性粒细胞迅速募集到感染和受伤的地方；它们有助于宿主抵抗病原体和炎症。大约在二十年前，首次观察到对病原体的反应是，一部分中性粒细胞会经历细胞凋亡或坏死以外的不同类型的细胞死亡。这涉及染色质的早期缩合，核区室和颗粒区室的共定位，最后将这种混合物释放到环境中。锚定核成分（例如组蛋白）或细胞成分的细胞外DNA支架链，其中一些具有很强的抗病原特性，例如弹性蛋白酶或髓过氧化物酶（MPO），被称为“嗜中性细胞外陷阱”或NETs，并具有有效的抗菌活性（Brinkmann等人，2004）。最近的证据表明，母语也非感染性疾病，包括癌症，系统性关联红斑狼疮，镰状细胞病，动脉粥样硬化和血栓形成（Jorch和Kubes，2017年）。尚不清楚NETs或其任何成分（无细胞DNA或组蛋白）是否作为驱动因素导致了这些疾病的病理，或者它们是否是免疫反应失衡的副产物。NETs在某些疾病中也可能充当生物标志物，并提供有关治疗方案功效的信息（Barnado等，2016）。NETs相关成分（例如弹性蛋白酶或MPO）存在于自身免疫性疾病患者的血浆中，也存在于感染中，这使这些分子作为生物标记物的特异性变得复杂。因此，迫切需要用于NETs表征的新方法，这些方法应在研究之间提供一致的标准，并且对于机械和临床应用均可靠。 ...
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| In vitro Induction and Detection of Acrosomal Exocytosis in Human Spermatozoa
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Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] The acrosome reaction is a highly regulated exocytotic event that primes spermatozoa for successful fertilization. Upon induction, acrosomal exocytosis proceeds via a wave of vesiculation that radiates across the sperm head, destabilizing the acrosomal vesicle and resulting in the release of the acrosomal contents. Having shed their acrosome, spermatozoa are then capable of penetrating the outer vestments of the oocyte and initiating fertilization. Accordingly, the failure of spermatozoa to complete an acrosome reaction represents a relatively common etiology in male infertility patients, and the ability to induce acrosomal exocytosis has found clinical utility in the evaluation of sperm fertilizing capacity. Here, we firstly describe protocols for driving the capacitation of human ...
[摘要] [摘要 ] 顶体反应是高度调控的胞吐事件，引发精子成功受精。诱导后，顶体胞吐作用通过一束囊泡波进行，该囊泡波辐射穿过精子头部，使顶体囊泡不稳定并导致顶体内容物释放。脱去顶体后，精子便能够穿透卵母细胞的外衣并开始受精。因此，在男性不育患者中，精子不能完成顶体反应代表了相对普遍的病因，并且诱导顶体胞吐作用的能力已在评估精子受精能力中发现了临床用途。在这里，我们首先描述驱动人类精子获能的方案 在体外使用化学成分确定的培养基以引发细胞完成顶体胞吐作用。然后，我们描述了常规用于诱导结合了生理激动剂（即甾体激素，孕酮）或药理试剂（即二价阳离子离子载体，A23187）的顶体胞吐作用的方法。最后，我们描述了组织化学和免疫荧光技术的应用，这些技术可用于研究顶体反应的完成。这样的协议对于临床和男科学研究实验室中的精子功能测试具有重要的诊断实用性。
[背景 ] 顶配体是雄性配子所特有的，是一种溶酶体样的膜细胞器，装饰在精子头部的前部区域，并由顶体内膜和外膜描绘（Hermo 等人，2010a和2010b）。如此形成的顶体囊泡封装了无数的结构和酶促组分，将其分隔为可溶或不可溶级分（Guyonnet 等，2012； Guyonnet 等，2014）。这些中的后者，称为顶体基质，用作稳定的支架，其允许在顶体反应期间受控释放受精所必需的基质相关蛋白（Guyonnet ...
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