| Non-radioactive Assay to Determine Product Profile of Short-chain Isoprenyl Diphosphate Synthases
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Isoprenoids represent the largest class of metabolites with amazing diversities in structure and function. They are involved in protecting plants against pathogens or herbivores or involved in attracting pollinators. Isoprenoids are derived from geranyl diphosphate (GPP; C10), farnesyl diphosphate (FPP; C15), geranylgeranyl diphosphate (GGPP; C20), and geranylfarnesyl diphosphate (GFPP; C25) that are in turn formed by sequential condensations of isopentenyl diphosphate (IPP; C5) with an allylic acceptor such as dimethylallyl diphosphate (DMAPP; C5), GPP, FPP, or GGPP in a reaction catalyzed by isoprenyl diphosphate synthases (IDSs). IDS enzyme assay for determination of prenyl diphosphate products is generally performed ...
[摘要] [Abstrac吨]类异戊二烯代表最大的一类代谢物在结构和功能惊人多样性。它们参与保护植物免受病原体或草食动物侵害，或参与吸引传粉媒介。（;çGPP类异戊二烯是从牻牛儿基二磷酸衍生的10 ），法呢基二磷酸（FPP;Ç 15 ），香叶基香叶基二磷酸（GGPP;Ç 20 ），和geranylfarnesyl二磷酸（GFPP; C ^ 25 ），它们又通过的顺序缩合形成异戊烯基二甲基磷酸酯（IPP; C 5 ）与烯丙基受体，例如二磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP; C 5），GPP，FPP或GGPP）由异戊二烯基二磷酸合酶（IDS）催化的反应。用于确定异戊二烯基二磷酸酯产物的IDS酶测定法通常是使用放射性标记的底物进行的，并且所形成的产物是通过使用昂贵的仪器（例如磷光成像仪，radio-GC或radio-HPLC）来鉴定的。尽管已经报道了一种用于测量粗植物提取物中IDS活性的非放射性测定方法，但它需要使用色谱结合串联质谱（LC / MS-MS）的复杂方法。在这里，我们描述了用于确定使用非放射性标记的IPP及其共同烯丙基底物DMAPP，GPP的IDS分析产物非放射性和简单廉价的测定法，和FPP。在测定中生成的异戊二烯基二磷酸产物的检测非常高效，并且在浓度大于40 µM的IPP和DMAPP / GPP / ...
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| A SsrA/NIa-based Strategy for Post-Translational Regulation of Protein Levels in Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] Strategies to control the levels of key enzymes of bacterial metabolism are commonly based on the manipulation of gene of interest within the target pathway. The development of new protocols towards the manipulation of biochemical processes is still a major challenge in the field of metabolic engineering. On this background, the FENIX (functional engineering of SsrA/NIa-based flux control) system allows for the post-translational regulation of protein levels, providing both independent control of the steady-state protein amounts and inducible accumulation of target proteins. This strategy enables an extra layer of control over metabolic fluxes in bacterial cell factories (see Graphical abstract below). The protocol detailed here describes the steps needed to design FENIX-tagged ...
[摘要] [摘要 ] 控制细菌代谢关键酶水平的策略通常基于目标途径内目标基因的操纵。朝着生化过程的操纵发展新协议仍然是代谢工程领域的主要挑战。在此背景下，FENIX（基于SsrA / NIa的流量控制功能工程）系统可进行蛋白质水平的翻译后调节，既提供对稳态蛋白质量的独立控制，又可诱导焦油获得蛋白质的积累。这一战略ENABL 上课了代谢流和细菌细胞工厂控制的一个额外层（见图形抽象下文）。此处详细介绍的协议描述了设计FENIX标签的蛋白质并使系统适应几乎所有代谢通量微调途径的步骤。
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图形概要
[背景 ] 控制蛋白质生产已成为已被一个具有挑战性的问题主要是解决由操纵它的生产的不同层次的调节，如所产生的DNA水平或蛋白质的（一个或多个）的量（吴等人，2016 ; Avcilar- Kucukgoze 等人，2017）。在DNA方面，已经在几种微生物中广泛研究了转录和翻译，从而能够设计和开发大量合成电路以改善生物生产过程（Guzmán 等，1995 ； Lutz 和Bujard ，1997）。相比之下，对蛋白质水平的研究较少，主要基于RNA干扰，核糖调节剂和特定的转录调节子（Isaacs ...
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