| Isolation and ex vivo Expansion of Human Limbal Epithelial Progenitor Cells
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Limbal stem cell transplantation has been used successfully to treat patients with limbal stem cell deficiency all over the world. However, long term clinical results often proved less satisfactory due to the low quality of the graft or inadequate properties of transplanted cells. To enhance the ex vivo expansion of human limbal epithelial stem or progenitor cells (LEPC) by preserving stem cell phenotype and to improve subsequent transplantation efficiency, cell-matrix interactions ex vivo should mimic the condition in vivo. The laminin isoforms preferentially expressed in the limbal niche can be used as a culture matrix for epithelial tissue engineering. We recently published the expansion of LEPC on various laminin isoforms and observed that laminin alpha ...
[摘要] [摘要] 角膜缘干细胞移植已成功用于治疗角膜缘干细胞缺乏症的患者。但是，由于移植物质量低或移植细胞特性不足，长期临床结果常常不能令人满意。为了通过保留干细胞表型来增强人角膜缘上皮干细胞或祖细胞（LEPC）的体外扩增，并提高后续移植效率，离体细胞-基质相互作用应模拟体内条件。在角膜缘利基中优先表达的层粘连蛋白同工型可以用作上皮组织工程的培养基质。我们最近发表了LEPC在各种层粘连蛋白同工型上的扩增，并观察到与组织培养板和其他层粘连蛋白同工型相比，层粘连蛋白α5衍生的基质通过保留干/祖细胞表型，支持LEPC的有效扩增。在这里，我们描述了通过重组人层粘连蛋白-511 E8片段（LN-511E8）作为培养底物，通过胶原酶消化和LEPC的有效扩增从尸体角膜缘组织分离LEPC的优化方案。
[背景] 角膜上皮干/祖细胞（LEPC）负责角膜上皮的持续更新，位于高度专业化和复杂的环境中。它包括特定的细胞外基质组分和在支撑角膜缘细胞小生corneo -scleral缘（Schermer 等人，1986; Cotsarelis 。等人，1989; 奥多涅斯。等人，2012 ;梅。等人，2012）。这种干/祖细胞储库的损坏或损伤可导致角膜新生血管形成，慢性炎症和与角膜混浊和视力丧失相关的基质瘢痕形成（Kenyon和Tseng，1989； Sangwan 和Tseng ...
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| Quantitative Kinetic Analyses of Histone Turnover Using Imaging and Flow Cytometry
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Dynamic histone changes occur as a central part of chromatin regulation. Deposition of histone variants and post-translational modifications of histones are strongly associated with properties of chromatin status. Characterizing the kinetics of histone variants allows important insights into transcription regulation, chromatin maintenance and other chromatin properties. Here we provide a protocol of quantitative and sensitive approaches to test the timing of incorporation and dissociation of histones using a two-color SNAP-labeling system, labelling pre-existing and newly-incorporated histones distinctly. Together with cell cycle synchronization methods and cell cycle markers, this approach enables a pulse-chase analysis to determine the turnover of histone variants during the cell cycle, ...
[摘要] [摘要] 动态的组蛋白变化是染色质调节的核心部分。组蛋白变体的沉积和组蛋白的翻译后修饰与染色质状态的属性密切相关。表征组蛋白变体的动力学特性可为深入了解转录调控，染色质维持和其他染色质特性提供重要信息。在这里，我们提供了一种定量和敏感方法的协议，以使用双色SNAP标记系统测试组蛋白的结合和解离时间，分别标记预先存在的和新结合的组蛋白。结合细胞周期同步方法和细胞周期标志物，这种方法可以进行脉冲追踪分析，以确定在细胞周期内使用成像或流式细胞仪方法以单细胞分辨率检测到的组蛋白变体的周转率。除了测试整体组蛋白更新，还可以使用成像方法解决组蛋白变体的细胞周期依赖性细胞定位。
[背景] 染色质重塑是真核细胞众多基本细胞活动的一部分（Geiman 和Robertson，2002；Clapier 和Cairns ，2009）。转录因子和RNA聚合酶的可及性通常与DNA甲基化和染色质状态的变化相关，包括可及性，翻译后的组蛋白修饰和组蛋白变体的沉积。组蛋白变体差异性地调节调节发育，细胞分化或其他生理活动的基因表达（Banaszynski 等，2010）。它们在DNA修复，端粒维护，异染色质形成和染色质分离中也发挥着不同的作用（Henikoff 和Smith，2015； Zink和Hake，2016）。此外，组蛋白变体的掺入失调与癌症有关（Vardabasso et ...
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| Assessing Gαq/15-signaling with IP-One: Single Plate Transfection and Assay Protocol for Cell-Based High-Throughput Assay
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Cell-based functional assays are an important part of compound screening and drug lead optimization, and they can also play a crucial role in the determination of the residues involved in ligand binding and signaling for a particular G-protein-coupled receptor. Conventional methods used for Gαq/15-coupled receptors rely on the use of fluorescent probes for Ca++ sensing (such as Fura-2 and Fluo-4) or on the incorporation of [3H]-inositol into inositol 1,4,5- triphosphate (IP3). However, these methods are not suitable for screening large libraries of compounds or for screening several mutants of the same receptor. In contrast, the IP-One assay by Cisbio is a TR-FRET assay suitable for large compound library screening when using stable cell lines that express ...
[摘要] [摘要 ] 基于细胞的功能测定法是化合物筛选和药物先导物优化的重要组成部分，并且它们可以也参与配体结合和信令残留量的测定起到至关重要的作用为一个特定的G蛋白偶联受体。用于Gα常规方法的q / 15 -偶联受体依赖于使用用于钙荧光探针++ 感测（如的Fura-2和的Fluo-4）或上掺入[的3 H] - 肌醇成肌醇1,4- ，5-三磷酸（IP3）。然而，这些方法不适合用于筛选大文库的化合物或用于筛选相同的受体的几个突变体。相反，IP-一个测定由Cisbio公司是TR-FRET测定适合大型化合物文库使用的稳定细胞株的筛选时，表达一个特定7TMR 。但是，当使用瞬时转染的7TMR突变体时，此检测方法并不理想，因为它需要两步操作进行细胞培养。因此，我们已经优化了IP-One的测定使用协议的在384孔反向转染方法的板。这为先前用于筛选Gαq / 15 偶联7TMR 的几种突变体的两步法提供了一种省时和省资源的替代方案。
[背景 ] 七跨膜受体（7TMR），也被称为G蛋白偶联受体，是超家族参与信号转导的最重要的跨膜蛋白。它们是临床批准药物的30％至50％的目标（Overington 等，2006）。Gαq / 15 偶联的7TMR激活磷脂酶Cβ（PLCβ），并产生D-肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3触发细胞内Ca ++ ...
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