Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 Real-Time PCR System

Company: ThermoFisher

Catalog#: A34322

Laser-Assisted Microdissection and High-Throughput RNA Sequencing of the Arabidopsis Gynoecium Medial and Lateral Domains

Valentín Luna-García and Stefan de Folter

Published online: 2024-09-05

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RNA Stability Measurements Using RT-qPCR in Arabidopsis Seedlings

Author:

Tianran Jia and Brandon H. Le,

Date:

2020-07-20

[Abstract] Steady-state mRNA levels are determined by both the rates of transcription and degradation. Regulation of mRNA stability and/or degradation are key factors that can significantly affect mRNA levels and its biological functions. mRNA stability can be measured indirectly after transcription inhibition. This protocol described a rapid and sensitive method of mRNA stability measurement through quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) after inhibition of RNA transcription by cordycepin in Arabidopsis seedlings. [摘要] [摘要] 稳态mRNA的水平取决于转录和降解的速率。mRNA稳定性和/或降解的调节是可以显着影响mRNA水平及其生物学功能的关键因素。mRNA的稳定性可以在转录抑制后间接测量。该协议描述了通过拟南芥幼苗中的虫草素抑制RNA转录后，通过定量逆转录PCR（RT-qPCR）进行mRNA稳定性测定的快速灵敏方法。

[背景] mRNA稳定性的调控是基因表达调控的关键控制点。mRNA的稳定性对基因表达，分子和细胞表型，以及最终对植物发育，防御和其他生物过程都具有深远的影响。多种方法，例如RNA印迹分析，原位杂交，可用于测量转录抑制后的mRNA稳定性。在此协议中，我们描述了一种快速灵敏的方法，通过虫草素抑制转录后，通过RT-qPCR测量mRNA的稳定性。虫草素或3'-脱氧腺苷是腺苷类似物（参见参考文献2 ）。可以将3'-脱氧腺苷掺入RNA，并由于3'位置不存在羟基部分而抑制转录延伸和RNA合成（参见参考文献6 ）。我们已经成功地使用了这种方便而灵敏的方法来测量拟南芥幼苗中几种低丰度mRNA 的稳定性，包括初级microRNA转录本（Jia 等，2017）。在这里，我们用详细的实验程序和数据分析方法介绍该协议。

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