| Optogenetic Tuning of Protein-protein Binding in Bilayers Using LOVTRAP
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Modern microscopy methods are powerful tools for studying live cell signaling and biochemical reactions, enabling us to observe when and where these reactions take place from the level of a cell down to single molecules. With microscopy, each cell or molecule can be observed both before and after a given perturbation, facilitating better inference of cause and effect than is possible with destructive modes of signaling quantitation. As many inputs to cell signaling and biochemical systems originate as protein-protein interactions near the cell membrane, an outstanding challenge lies in controlling the timing, location and the magnitude of protein-protein interactions in these unique environments. Here, we detail our procedure for manipulating such spatial and temporal protein-protein ...
[摘要] [摘要] 现代显微镜方法是研究活细胞信号转导和生化反应的强大工具，使我们能够观察这些反应的时间和位置，从细胞水平到单个分子。利用显微镜，可以在给定的扰动之前和之后观察每个细胞或分子，比起破坏性的信号定量方法，可以更好地推断因果关系。由于细胞信号传导和生化系统的许多输入源于细胞膜附近的蛋白质-蛋白质相互作用，因此一个巨大的挑战在于控制时间，位置 以及这些独特环境中蛋白质与蛋白质相互作用的程度。在这里，我们详细介绍了在封闭的显微镜系统中使用这种基于时空的蛋白质-蛋白质相互作用系统，在支持的脂质双分子层上使用基于LOVTRAP的光反应性蛋白质-蛋白质相互作用系统的程序。系统可以在几秒钟内做出响应，并且可以将细节图案化到1微米级别。我们使用了该技术来解锁T细胞信号传导的基本方面，并且该方法可推广到许多其他细胞信号传导和生化环境。
背景技术细胞信号传导和细胞生物学中的问题通常集中在细胞如何感知和响应其环境上。进行这些细胞决定的信号级联反应包含的蛋白质可以在几秒钟到几分钟的时间内将纳米级移动到微米级。某些常用方法，例如蛋白质印迹，qPCR ...
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| Generation and Testing of Fluorescent Adaptable Simple Theranostic (FAST) Proteins
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] This protocol provides a step-by-step method to create recombinant fluorescent fusion proteins that can be secreted from mammalian cell lines. This builds on many other recombinant protein and fluorescent protein techniques, but is among the first to harness fluorescent fusion proteins secreted directly into cell culture supernatant. This opens new possibilities that are not achievable with proteins produced in bacteria or yeast, such as direct use of the fluorescent protein-secreting cells in live co-culture assays. The Fluorescent Adaptable Simple Theranostic (FAST) protein system includes a histidine purification tag and a tobacco etch virus (TEV) cleavage site, allowing the purification tag and fluorescent protein to be removed for therapeutic use. This protocol is split into five ...
[摘要] [摘要] 该方案提供了一种逐步建立重组荧光融合蛋白的方法，可从哺乳动物细胞系分泌。这项技术建立在许多其他重组蛋白和荧光蛋白技术的基础上，但它是第一个利用荧光融合蛋白直接分泌到细胞培养上清液中的技术之一。这为细菌或酵母产生的蛋白质开辟了新的可能性，例如直接使用荧光蛋白分泌细胞进行活体共培养实验。该荧光适应性简单热（FAST）蛋白系统包括组氨酸纯化标签和烟草蚀刻病毒（TEV）裂解位点，允许去除纯化标签和荧光蛋白用于治疗用途。该方案分为五个部分：（A）感兴趣基因（GOI）和感兴趣蛋白（POI）的电子表征；（B）表达载体的设计；（C）表达载体的组装；（D）用表达载体转染真核细胞系；（E）检测重组蛋白。这种广泛的方案只需聚合酶链反应（PCR）和细胞培养训练即可完成。另外，协议的每个部分都可以独立使用。
[背景] ...
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