| A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The assay takes advantage of the well-known retrograde trafficking of cholera toxin engineered with split-fluorescent proteins to generate novel tools for immediate monitoring of intracellular trafficking. ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化，因此是一个关键的分选步骤。然而，有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里，我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性，利用裂解荧光蛋白产生了新的工具，用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础，以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力，以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络（TGN）。在从分选内体产生的其他贩运途径中，通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤（Johannes和Popoff，2008）。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网（ER）的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成，并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病（Cho等人，2012年；Personnic等人，2016年；Williams和Tsai，2016年）。
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| Generation of T cells from Human and Nonhuman Primate Pluripotent Stem Cells
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Pluripotent stem cells (PSCs) have the potential to provide homogeneous cell populations of T cells that can be grown at a clinical scale and genetically engineered to meet specific clinical needs. OP9-DLL4, a stromal line ectopically expressing the Notch ligand Delta-like 4 (DLL4) is used to support differentiation of PSCs to T-lymphocytes. This article outlines several protocols related to generation of T cells from human and non-human primate (NHP) PSCs, including initial hematopoietic differentiation of PSC on OP9 feeders or defined conditions, followed by coculture of the OP9-DLL4 cells with the PSC-derived hematopoietic progenitors (HPs), leading to efficient differentiation to T lymphocytes. In addition, we describe a protocol for robust T cell generation from hPSCs conditionally ...
[摘要] [摘要] 多能干细胞（PSCs）有潜力提供同质的T细胞群体，这些细胞可以在临床规模上生长，并通过基因工程来满足特定的临床需求。OP9-DLL4是一种异位表达Notch配体Delta-like 4（DLL4）的基质细胞系，用于支持psc向T淋巴细胞的分化。本文概述了从人类和非人类灵长类（NHP）PSC中产生T细胞的几种方法，包括在OP9喂食者或特定条件下对PSC进行初始造血分化，然后将OP9-DLL4细胞与PSC衍生的造血祖细胞（HPs）共培养，从而有效地分化成T淋巴细胞。此外，我们描述了一个从有条件表达ETS1的hPSCs中产生健壮T细胞的方案。所提出的协议提供了一个平台，用于疾病建模和评估其在大型动物模型免疫治疗中的应用。
[背景] T淋巴细胞（T细胞）在细胞介导的免疫反应中起着关键作用，参与肿瘤细胞的监测和杀伤。在过去的几十年里，已经开发了几种策略来重定向、培养和/或增强抗肿瘤的T淋巴细胞（Houot等人，2015年；June等人，2018年），并将其用于基于T细胞的过继免疫治疗。最近的临床试验表明，用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗复发性和难治性淋巴瘤患者的疗效显著（Riviere和Sadelain，2017）。
人类多能干细胞（hPSCs），包括胚胎（hESCs）和诱导（hiPSCs），为生产用于过继性细胞免疫疗法的T细胞提供了一种很有前景的资源，可与基因工程技术相结合，产生现成的CAR ...
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