| Ligand and Carbohydrate Engagement (LACE) Assay and Fluorescence Quantification on Murine Neural Tissue
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] The interaction between cell surface heparan sulphate and diffusible ligands such as FGFs is of vital importance for downstream signaling, however, there are few techniques that can be used to investigate this binding event. The ligand and carbohydrate engagement (LACE) assay is a powerful tool which can be used to probe the molecular interaction between heparan sulphate and diffusible ligands and can detect changes in binding that may occur following genetic or pharmacological intervention. In this protocol we describe an FGF17:FGFR1 LACE assay performed on embryonic mouse brain tissue. We also describe the method we have used to quantify changes in fluorescent LACE signal in response to altered HS sulphation.
[摘要] [摘要]细胞表面硫酸乙酰肝素与可扩散配体（例如FGFs）之间的相互作用对于下游信号传导至关重要，但是，很少有技术可用于研究这种结合事件。配体和碳水化合物结合（LACE）分析是一种功能强大的工具，可用于探测硫酸乙酰肝素与可扩散配体之间的分子相互作用，并可检测在遗传或药理学干预后可能发生的结合变化。在此协议中，我们描述了在胚胎小鼠脑组织上进行的FGF17：FGFR1 LACE分析。我们还描述了我们用来量化荧光LACE信号响应HS硫酸盐改变的变化的方法。
[背景]硫酸乙酰肝素（HS）是一种细胞外基质和细胞表面糖胺聚糖分子，可通过硫酸化进行广泛修饰。HS与包括FGF，Wnt，BMP和Slits在内的多种具有重要发展意义的信号分子相互作用。例如，在FGF信号传导期间，HS充当共受体，促进FGF配体与细胞表面FGFR受体的结合。此形成HS：FGF：FGFR需要复杂的对FGF信号发生（阿伦等人，2001） 。已显示HS的差异硫酸化会影响FGF配体与其FGFR细胞表面受体的结合。在我们最近的论文中，我们使用了配体和碳水化合物结合（LACE）分析方法来检测HS和FGF蛋白之间的相互作用（Clegg et ...
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| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of other putative polyamine transporters, such as isoforms of the P5B transport ATPases.
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| Organotypic Slice Culture of the Embryonic Mouse Brain
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Organotypic slice culture is a powerful technique for exploring the embryonic development of the mammalian brain. In this protocol we describe a basic slice culture technique we have used for two sets of experiments: axon guidance transplant assays and bead culture assays.
[摘要] [摘要]器官型切片培养是探索哺乳动物大脑胚胎发育的有力技术。在这个方案中，我们描述了一种基本的切片培养技术，我们已经用于两组实验：轴突引导移植实验和珠子培养实验。
[背景] 器官型切片培养是近年来广泛应用的一种技术，在神经发育领域已成为一种特别流行的技术。它的最大优点是可以在体外培养发育中的神经细胞，同时保持组织的体内结构。在该方案中，我们描述了我们在最近的论文（Clegg等人，2019）中用于两个实验的切片培养技术。首先，我们进行了轴突引导移植实验，将荧光标记的组织移植到非荧光宿主切片上，观察轴突的生长情况。这是先前用于研究胼胝体发育的一个改进版本，但可以很容易地用于检查其他轴突束，如丘脑皮质束（Niquille et al.，2009）。其次，我们进行了微珠培养实验，将浸有重组FGF蛋白的小球植入组织中，检测组织对FGF蛋白的分子和细胞反应。以这种方式使用浸过蛋白的小球提供了一种在特定位置聚焦输送重组蛋白的方法，与将所有组织均匀暴露于蛋白质的浴敷法不同。这模拟了体内的情况，即形态发生素（如FGF17）在特定的解剖位置表达，然后在组织中扩散。该技术可用于探索对多种不同重组蛋白或药物的反应。
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