| Analysis of Pseudomonas aeruginosa c-di-GMP High and Low Subpopulations Using Flow-assisted Cell Sorting (FACS) and Quantitative Reverse Transcriptase PCR (qRT-PCR)
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP) is a second messenger signaling molecule that drives the transition from planktonic to the biofilm mode of growth in many bacterial species. Pseudomonas aeruginosa has at least two surface sensing systems that produce c-di-GMP in response to surface attachment, the Wsp and Pil-Chp systems. We recently used a plasmid-based c-di-GMP reporter (pPcdrA::gfp) to describe how the Wsp system generates heterogeneity in surface sensing, resulting in two physiologically distinct subpopulations of cells during early biofilm formation. One subpopulation has elevated c-di-GMP and produces biofilm matrix, serving as the founders of initial microcolonies. The other subpopulation has low c-di-GMP and engages in surface motility, allowing for exploration of the ...
[摘要] [摘要]环状双鸟苷酸单磷酸酯（c-di-GMP）是第二个信使信号分子，它驱动许多细菌物种从浮游生物向生物膜生长的转变。铜绿假单胞菌具有至少两个响应于表面附着而产生c-di-GMP的表面传感系统，即Wsp和Pil-Chp系统。我们最近使用了基于质粒的c-di-GMP报告基因（pP cdrA :: gfp ）描述Wsp系统如何在表面感应中产生异质性，从而在早期生物膜形成过程中导致两个生理上不同的细胞亚群。一个亚群的c-di-GMP升高并产生生物膜基质，从而成为最初的微殖民地的奠基人。另一个亚群的c-di-GMP较低，并且具有表面运动性，可以探索表面。在这里，我们描述了一项关键实验的协议，以确认我们在表面传感过程中对c-di-GMP异质性的初步观察：使用流辅助细胞分选（FACS）来分离具有高和低c- di- G的细胞亚群GMP报告基因活性，然后是已知响应于细胞c-di-GMP水平（pelA和pslA ）被转录调控的基因的定量逆转录酶PCR（qRT-PCR ）。该方案可以被其他人修改以分离高c-di-GMP铜绿假单胞菌细胞的亚群，这些亚群在基因上是相同的，但在表型上是不同的，以便将来像我们一样检查特定的mRNA转录本，或者大概用于其他应用如RNAseq，蛋白质组学或TNseq。
图形概要：
[背景]第二信使信号分子环状单鸟苷酸单磷酸酯（c-di-GMP）可使细菌响应环境条件而迅速修饰其细胞表面。双鸟苷酸环化酶（DGC）是含有从两个GTP分子合成c-di-GMP的GGDEF氨基酸序列基序的蛋白质，磷酸二酯酶（PDE）是具有EAL或HD-GYP基序的蛋白，可将c-di-GMP水解为线性pGpG或GMP ...
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| Preparation of Drosophila Polytene Chromosomes, Followed by Immunofluorescence Analysis of Chromatin Structure by Multi-fluorescence Correlations
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Drosophila larval salivary gland polytene chromosome squashes have been used for decades to analyze genome-wide protein-binding patterns, transcriptional activation processes, and changes in chromatin structure at specific genetic loci. There have been many evolutions of the squashing protocol over the years, with sub-optimal reproducibility and low sample success rate as accepted caveats. However, low sample success rates are an obvious disadvantage when polytene chromosomes are used for more high-throughput approaches, such as genetic or antibody screens, or for experiments requiring high-quality chromosome structure preservation. Here we present an exceptionally reproducible squashing and fluorescence staining protocol, which generates high-quality fluorescence images on ...
[摘要] [摘要] 果蝇几十年来，幼虫唾液腺多线染色体压片被用来分析全基因组蛋白质结合模式、转录激活过程以及特定基因位点染色质结构的变化。在过去的几年中，压榨方案已经有了许多改进，次优的重复性和较低的样本成功率是公认的警告。然而，当多线染色体用于更高通量的方法，如遗传或抗体筛查，或用于需要高质量染色体结构保存的实验时，低样本成功率是一个明显的缺点。在这里，我们提出了一个特别可重复的挤压和荧光染色协议，它可以在扩散良好的染色体上生成高质量的荧光图像。接下来是我们的新的、半自动的MATLAB分析程序，用于以逐像素的方式确定多线染色体上单个位点上感兴趣的荧光信号之间的相关性。在我们的案例中，我们已经用这种方法来评估染色体在基因组位点的变化，这些位点被核孔蛋白的异位靶向。我们的分析程序的使用提高了对染色质结构的变化或染色质的蛋白质补充的无偏结论的能力，而不考虑免疫荧光染色的样本变化。由于它只是基于特定位置的荧光强度的差异，因此所提供的分析程序不局限于对多线染色体的分析，并且可以应用于许多不同的上下文中，其中任何特定位置的荧光信号之间的相关性是感兴趣的。
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