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Date:
2020-07-05
[Abstract] Every living cell relies on signal transduction pathways comprised of protein-protein interactions (PPIs). In many cases, these PPIs are between a folded protein domain and a short linear motif (SLiM) within an unstructured region of a protein. As a result of this small interaction interface (3-10 amino acids), the affinities of SLiM-mediated interactions are typically weak (Kds of ~1-10 µM), allowing physiologically relevant changes in cellular concentrations of either protein partner to dictate changes in occupancy and thereby transmit cellular signals. However, these weak affinities also render detection and quantitative measurement of these interactions challenging and labor intensive. To address this, we recently developed MRBLE-pep, a technology that employs ...
[摘要] [摘要] 每个活细胞都依赖于由蛋白-蛋白相互作用（PPI）组成的信号转导途径。在许多情况下，这些PPI位于蛋白质非结构化区域内的折叠蛋白质结构域和短线性基序（SLiM ）之间。由于这种小交互界面（3-10个氨基酸）的结果，的亲和力了SLiM 介导的相互作用通常是弱（ķ d 小号〜1-10μM的），允许在任一蛋白伴侣的细胞浓度至生理学相关的变化指示占用率的变化，从而传输蜂窝信号。然而，这些弱的亲和力也使得对这些相互作用的检测和定量测量具有挑战性并且劳动强度大。为了解决这个问题，我们最近开发了MRBLE-pep，该技术利用在光谱编码的水凝胶珠上合成的肽库，可以并行测量蛋白质和许多不同肽之间的多重亲和力。与传统方法相比，该方法显着减少了蛋白质和多肽的数量以及测量蛋白质-肽亲和力所需的时间。在这里，我们提供了详细的协议，描述了如何：（1）功能化带有游离胺基的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）MRBLE磁珠，（2）在功能化的MRBLE上合成肽库，（3）通过MALDI质量验证合成的肽序列光谱分析和量化MRBLE上肽覆盖的均匀性，（4）在多重蛋白结合测定中使用MRBLE结合的肽库，以及（5）分析结合数据以确定结合亲和力。我们预计，该协议对于其他希望在自己的实验室中使用MRBLE-pep的研究人员以及对固相肽合成和蛋白质-蛋白质结合测定法开发广泛感兴趣的研究人员而言，将证明是有用的。
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