| In vitro Reconstitution Assays of Arabidopsis 20S Proteasome
|
|
Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] The majority of cellular proteins are degraded by the 26S proteasome in eukaryotes. However, intrinsically disordered proteins (IDPs), which contain large portions of unstructured regions and are inherently unstable, are degraded via the ubiquitin-independent 20S proteasome. Emerging evidence indicates that plant IDP homeostasis may also be controlled by the 20S proteasome. Relatively little is known about the specific functions of the 20S proteasome and the regulatory mechanisms of IDP degradation in plants compared to other species because there is a lack of systematic protocols for in vitro assembly of this complex to perform in vitro degradation assays. Here, we present a detailed protocol of in vitro reconstitution assay of the 20S proteasome in Arabidopsis by modifying previously ...
[摘要] [摘要]大多数细胞蛋白的s的降解通过26S在真核生物蛋白酶。但是，内在无序的蛋白质（IDPs）包含大量的非结构化区域，并且内在地不稳定，因此很容易通过不依赖泛素的20S蛋白酶体降解。越来越多的证据最近显示ň植物境内流离失所者的平衡也可以通过20S蛋白酶控制。但是，由于缺乏用于体外分离20S蛋白酶体和降解测定的系统协议，因此我们对植物中IDP和20S蛋白酶体降解的功能和调控机制的研究和理解一直处于婴儿期与其他生物。在这里，我们通过采用和修改先前公开的方法，对拟南芥中20S蛋白酶体进行体外重组测定的详细方案。在此获得20S核心蛋白酶体的主要策略是从26S蛋白酶体中去除19S调节亚基。该协议包括两个主要部分：1）的来自表达表位标记的PAG1稳定的转基因品系20S蛋白酶体亲和纯化，的20S蛋白酶（程序AD）的基本组成部分; 2 ）体外20S蛋白酶体降解测定法（方法E）。我们预计该协议将提供一种简单有效的方法来研究体外20S蛋白酶体降解，并促进植物中蛋白质代谢的研究。
[背景]蛋白质的降解通常是通过真核生物中的蛋白酶体来实现的。整合的26S蛋白酶体由两个亚颗粒组成：一个或两个末端的19S调节颗粒（RP），用作蛋白酶体激活剂；和20S核心蛋白酶体（CP），执行降解过程。大多数真核蛋白被多聚泛素化并导入26S蛋白酶体进行降解。然而，含有固有蛋白质无序已发现的区域直接通过破坏一个由20S蛋白酶的泛素依赖性降解（本日产等人，2014） ...
|
|
|
| In-vitro GLP-1 Release Assay Using STC-1 Cells
|
|
Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Enteroendocrine cells (EECs) are known chemosensors in the gastrointestinal (GI) epithelium. They release a diversity of gut hormones in response to various stimuli. Here, we report an in-vitro assay to measure GLP-1 release from cultured murine EEC’s under fatty acid stimulation.
[摘要] [摘要] 肠内分泌细胞（EEC）是胃肠道（GI）上皮中的已知化学传感器。它们响应各种刺激而释放多种肠激素。在这里，我们报告了一种体外测定法，以测量在脂肪酸刺激下培养的鼠EEC中GLP-1的释放。
[背景] 肠上皮是人体与环境之间最大的界面。该界面由单个上皮层组成，包含多个具有独特功能角色的不同细胞类型。与LGR5阳性上皮干细胞不同，肠内分泌细胞（EEC）沿整个胃肠道散布在整个上皮中。EEC通过产生和分泌多种激素，在对营养和其他刺激的反应中起关键作用。传统上，这些细胞是按照荷尔蒙特征来分类的（Nausheen 等人，2013； Latorre 等人，2016； Verhoeckx 等人，2015a），尽管随着单细胞RNA测序的到来，我们逐渐意识到这些细胞中的大多数分泌多种激素（Haber 等人，2017; Billing 等人，2019）。EEC的亚型L细胞由胰高血糖素样肽1和2（GLP-1和GLP-2）的产生定义，也可能分泌YY肽（PYY）和胰岛素样肽5（INSL5） 。大多数L细胞见于回肠末端和结肠，而另一些也见于十二指肠和空肠近端。L细胞表面的受体使它们能够直接感知管腔成分并产生适当的激素反应。L细胞上最显着的营养成分和食物成分受体是经典的味觉受体，游离脂肪酸受体以及蛋白质及其产物的受体（Drucker 和Nauck ，2006年；Furness ...
|
|
|
| Protocol for Peptide Synthesis on Spectrally Encoded Beads for MRBLE-pep Assays
|
|
Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Every living cell relies on signal transduction pathways comprised of protein-protein interactions (PPIs). In many cases, these PPIs are between a folded protein domain and a short linear motif (SLiM) within an unstructured region of a protein. As a result of this small interaction interface (3-10 amino acids), the affinities of SLiM-mediated interactions are typically weak (Kds of ~1-10 µM), allowing physiologically relevant changes in cellular concentrations of either protein partner to dictate changes in occupancy and thereby transmit cellular signals. However, these weak affinities also render detection and quantitative measurement of these interactions challenging and labor intensive. To address this, we recently developed MRBLE-pep, a technology that employs ...
[摘要] [摘要] 每个活细胞都依赖于由蛋白-蛋白相互作用（PPI）组成的信号转导途径。在许多情况下，这些PPI位于蛋白质非结构化区域内的折叠蛋白质结构域和短线性基序（SLiM ）之间。由于这种小交互界面（3-10个氨基酸）的结果，的亲和力了SLiM 介导的相互作用通常是弱（ķ d 小号〜1-10μM的），允许在任一蛋白伴侣的细胞浓度至生理学相关的变化指示占用率的变化，从而传输蜂窝信号。然而，这些弱的亲和力也使得对这些相互作用的检测和定量测量具有挑战性并且劳动强度大。为了解决这个问题，我们最近开发了MRBLE-pep，该技术利用在光谱编码的水凝胶珠上合成的肽库，可以并行测量蛋白质和许多不同肽之间的多重亲和力。与传统方法相比，该方法显着减少了蛋白质和多肽的数量以及测量蛋白质-肽亲和力所需的时间。在这里，我们提供了详细的协议，描述了如何：（1）功能化带有游离胺基的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）MRBLE磁珠，（2）在功能化的MRBLE上合成肽库，（3）通过MALDI质量验证合成的肽序列光谱分析和量化MRBLE上肽覆盖的均匀性，（4）在多重蛋白结合测定中使用MRBLE结合的肽库，以及（5）分析结合数据以确定结合亲和力。我们预计，该协议对于其他希望在自己的实验室中使用MRBLE-pep的研究人员以及对固相肽合成和蛋白质-蛋白质结合测定法开发广泛感兴趣的研究人员而言，将证明是有用的。
...
|
|
|