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Date:
2020-06-20
[Abstract] Nucleocytoplasmic transport deficits are suggested to play a role in neurodegenerative disorders, including amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Given the importance and complexity of this process, understanding when these aberrations occur and which pathways are involved is of great importance. Here, we make use of CRISPR-Cas9 technology to design cell lines stably expressing fluorophore proteins shuttling between the nucleus and cytoplasm by karyopherins of choice. To validate this protocol, we measured an ALS-associated nucleocytoplasmic transport pathway in the presence of the disease-associated peptide poly-PR. This technique allows measuring a particular active nucleocytoplasmic transport pathway in intact cells in a neurodegenerative disease-associated context. Moreover, these ...
[摘要] [摘要]核细胞质运输缺陷被认为在神经退行性疾病中发挥作用，包括肌萎缩性侧索硬化症（ALS）。鉴于这一过程的重要性和复杂性，了解这些畸变何时发生以及涉及哪些途径是非常重要的。在这里，我们利用CRISPR-Cas9技术来设计细胞系，稳定地表达荧光素蛋白在细胞核和细胞质之间穿梭的选择的卡里菲林。为了验证这个协议，我们测量了一个ALS相关的核细胞质运输途径，在疾病相关的多肽poly-PR的存在。这种技术允许测量在神经退行性疾病相关的背景下，在完整细胞中的一个特定的活性核细胞质运输途径。此外，这些实验可以在不需要昂贵的设备的情况下进行，并有可能升级为高通量筛选目的。
[背景]核细胞质运输对细胞稳态至关重要，并通过形成水通道的大型多蛋白复合物穿过核膜，称为核孔复合物（NPCs）（Stoffler et al., 1999; Ryan and Wente, 2000)。虽然这些通道允许小蛋白被动地平衡穿过核膜（被动运输），但大多数蛋白质似乎是由核素主动运输的，即进口蛋白或出口蛋白（主动运输）。含有核定位信号(NLS)的货物蛋白被导入素所定位。已经确定了各种受体介导的导入途径，但最有特色的途径涉及导入素-β1/导入素-α(KPNB1/KPNAx)，其中货蛋白含有经典的NLS(cNLS)，以SV40大T抗原NLS为例(Lange et al., ...
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