| A Novel and Robust Single-cell Trapping Method on Digital Microfluidics
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Author:
Date:
2020-10-05
[Abstract] Due to cell heterogeneity, the differences among individual cells are averaged out in bulk analysis methods, especially in the analysis of primary tumor biopsy samples from patients. To deeply understand the cell-to-cell variation in a primary tumor, single-cell culture and analysis with limited amount of cells are in high demand. Microfluidics has been an optimum platform to address the issue given its small reaction volume requirements. Digital microfluidics, which utilizes an electric signal to manipulate individual droplets has shown promise in cell-culture with easy controls. In this work, we realize single cell trapping on digital microfluidic platform by fabricating 3D microstructures on-chip to form semi-closed micro-wells. With this design, 20% of 30 x 30 array can be occupied by ...
[摘要] [摘要]由于细胞的异质性，在批量分析方法中，尤其是在对患者的原发性肿瘤活检样品进行分析时，会平均各个细胞之间的差异。为了深入了解原发性肿瘤中的细胞间差异，对细胞数量有限的单细胞培养和分析提出了很高的要求。鉴于其小反应量的要求，微流体一直是解决该问题的最佳平台。数字微流体，它利用一个电信号操纵单个液滴小号显示PROMIS ê在细胞培养物与易控制。在这项工作中，我们通过在芯片上制造3D微结构以形成半封闭微孔，在数字微流控平台上实现单细胞捕获。通过这种设计，隔离的单个单元可以占用30 x 30阵列的20％。我们还使用低蒸发硅油和氟化表面活性剂来降低液滴驱动电压并防止液滴蒸发，同时在长期培养（24 h）中允许细胞呼吸。如本协议所示，在数字微流控技术上进行单细胞捕获的主要步骤包括3D微结构设计，芯片上3D微结构构建以及带有表面活性剂的油膜，用于芯片上单细胞捕获。
[背景]大的细胞群中的细胞异质性是常见的。单个细胞分析将提供有关大量分析中随机平均值所掩盖的细胞间变化的更准确信息。作为单个细胞分析的第一步，单细胞培养变得非常重要。
流式细胞术是单细胞分析的常用方法。然而，大细胞数量（超过10,000个）的需求限制了其在有限珍贵样品研究中的应用。具有低样品消耗，低分析成本的优点，许多科学家一直在追求微流体技术，特别是在样品采集受限和需要昂贵试剂（例如基于细胞的药物筛选）的研究领域。利用电信号操纵单个液滴的数字微流控技术在细胞培养相关研究中显示出了其前途。然而，这是难以实现的考虑几百纳升大小的液滴的数字微流体在一个平面电极单细胞捕获小号。尽管一些研究人员报告说他们可以在数字微流控技术上分离单个细胞，但其缺点阻碍了它们的进一步应用。例如，Gidrol的组通过调整细胞悬浮液的浓度来实现单细胞分离（对手等人，2014） ...
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| Generation of Functional Mouse Hippocampal Neurons
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] Primary culture of mouse hippocampal neurons is a very useful in vitro model for studying neuronal development, axonal and dendritic morphology, synaptic functions, and many other neuronal features. Here we describe a step-by-step process of generating primary neurons from mouse embryonic hippocampi (E17.5/E18.5). Hippocampal neurons generated with this protocol can be plated in different tissue culture dishes according to different experimental aims and can produce a reliable source of pure and differentiated neurons in less than one week. This protocol covers all the steps necessary for the preparation, culture and characterization of the neuronal culture, including the illustration of dissection instruments, surgical procedure for embryos’ isolation, culturing conditions and ...
[摘要] [摘要] 原代培养小鼠海马神经元是一种非常有用的体外模型用于研究神经元的发育，轴突和树突的形态，突触功能，以及许多其他神经元的特征。这里我们描述了从小鼠胚胎海马（E17.5/E18.5）产生初级神经元的一步一步的过程。根据不同的实验目的，用该方法产生的海马神经元可以在不同的组织培养皿中进行培养，并能在不到一周的时间内产生一个可靠的来源。该方案涵盖了神经元培养物的制备、培养和鉴定的所有必要步骤，包括解剖器械的说明、胚胎分离的手术程序、培养条件以及培养物纯度和分化的评估。通过分析培养6天时的钙显像动力学来评估神经元的活性。
[背景] 海马体是一个非常典型的大脑结构，对重要的大脑功能如记忆、空间导航、情绪记忆和学习至关重要。从解剖学上讲，小鼠海马体有一个清晰的C形结构，很容易定位和分离。在细胞水平上，它主要由锥体细胞组成，与其他脑区相比，中间神经元和胶质细胞较少（Kaech和Banker，2006）。因此，海马体是从野生型或基因工程小鼠模型中产生高纯度原代神经元培养物的理想区域，可用于疾病建模或研究神经元功能的多个方面，如突触传递和电生理特性、对神经毒性的敏感性，分化与衰老（；；；；）。Busche，2018Koyama和Ikegaya，2018Molnar，2011Wu等人，2019Rush等人，2020年
已经制定了许多协议，通过与神经胶质喂食器共同培养神经元来产生皮层和海马神经元（Kaech和Banker，2006），描述了用水凝胶微纤维封装的星形胶质细胞的三维神经元培养系统（Kim等人，2020年），长期向培养基中补充生长因子神经元培养（Ray ...
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| Preparation of HeLa Total Membranes and Assay of Lipid-inhibition of Serine Palmitoyltransferase Activity
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Serine palmitoyltranferase (SPT) is a pyridoxal 5′ phosphate (PLP)-dependent enzyme that catalyzes the first and rate-limiting step of de novo synthesis of sphingolipids. SPT activity is homeostatically regulated in response to increased levels of sphingolipids. This homeostatic regulation of SPT is mediated through small ER membrane proteins termed the ORMDLs. Here we describe a procedure to assay ORMDL dependent lipid inhibition of SPT activity. The assay of SPT activity using radiolabeled L-serine was developed from the procedure established by the Hornemann laboratory. The activity of SPT can also be measured using deuterated L-serine but it requires mass spectrometry, which consumes money, time and instrumentation. The ORMDL dependent lipid inhibition of SPT activity can be ...
[摘要] [摘要] 丝氨酸Palmitoyltranferase （SPT）是吡哆醛5 ' 磷酸（PLP）依赖酶催化第一和限速步骤中从头合成鞘脂。SPT活动是Homeostatically调控响应水平的提高鞘脂。这SPT的稳态调节是通过小ER膜蛋白介导称为ORMDLs。在这里，我们描述了一种方法用放射性标记的L-丝氨酸以测定SPT活性的SPT活性。测定的ORMDL依赖性抑制脂质从由规定的程序被开发Hornemann 实验室。 SPT的活性也可以使用氘化的L-丝氨酸进行测定，但需要进行质谱分析，这会耗费金钱，时间和仪器。可以在细胞和无细胞系统中研究ORMDL依赖性脂质对SPT活性的抑制作用。在这里，我们提供了详细的协议来测量存在短链（C8-神经酰胺）或长链神经酰胺（C24-神经酰胺）时SPT活性。该协议的最大优势之一我们通过在HeLa细胞膜中提供外源鞘氨醇和24：1酰基辅酶A通过内源性神经酰胺合酶生成长链神经酰胺来实现这一目标。需要精密的仪器。
[背景 ] 丝氨酸palmit oyltranferase （SPT）是一种多亚基酶是在真核生物和原核生物一些广泛表达（花田等人，1997; Ikushiro 。等人，2001; Hornemann 等人，2007）.The ...
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