| Expression and Purification of the Human Cation-chloride Cotransporter KCC1 from HEK293F Cells for Structural Studies
|
|
Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Cation-chloride cotransporters (CCCs) mediate the coupled, electroneutral symport of cations such as Na+ and/or K+ with chloride across membrane. Among CCCs family, K-Cl cotransporters (KCC1-KCC4) extrude intracellular Cl- by the transmembrane K+ gradient. In humans, these KCCs play vital roles in the physiology of the nervous system and kidney. However, mechanisms underlying the KCCs specific properties remain poorly understood, partly because purification of membrane proteins is challenging. Here, we present the protocol for purifying the full-length KCC1 from HEK293F cells used in our recent publication (Liu et al., 2019). The procedure may be adapted for functional and structural studies.
[摘要] [摘要]阳离子-氯化物共转运蛋白（CCC）介导诸如Na +和/或K +的阳离子与氯离子在膜上的耦合，电中性共价。间幼儿中心家庭，K-CL协同转运蛋白（KCC1-KCC4）抽UDE细胞内氯-通过跨膜ķ +梯度。在人类中，这些KCC在神经系统和肾脏的生理中起着至关重要的作用。然而，特定的KCC性质保持基本机制知之甚少，部分是因为膜蛋白的纯化是具有挑战性的。在这里，我们介绍了从我们最近的出版物中使用的HEK293F细胞中纯化全长KCC1的方案（Liu等人，2019）。该程序可适用于功能和结构研究。
[背景]人类溶质载体12（SLC12 ）基因家族编码阳离子的氯化物协同转运蛋白（CCCS）介导Cl组成的电中性同向转运-和阳离子的Na +或（和）K +跨越质膜。根据其转运特性和氨基酸序列定义，CCC可分为几个分支，包括两个Na-K-2Cl协同转运蛋白（NKCC1和NKCC2），一个Na-Cl协同转运蛋白（NCC）和四个K-Cl协同转运蛋白（KCC1-KCC4 ）。CCC在细胞体积调节，肾脏盐分重吸收和神经元GABA能调节中起重要作用。CCC的结构，生化和生物物理研究涉及在去污剂溶解状态下蛋白质生产和稳定方面的挑战。杆状病毒转导HEK293F细胞（BacMam）系统是异源表达由Eric ...
|
|
|
| Electrophoretic Mobility Shift Assay of in vitro Phosphorylated RNA Polymerase II Carboxyl-terminal Domain Substrates
|
|
Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Eukaryotic RNA polymerase II transcribes all protein-coding mRNAs and is highly regulated. A key mechanism directing RNA polymerase II and facilitating the co-transcriptional processing of mRNAs is the phosphorylation of its highly repetitive carboxyl-terminal domain (CTD) of its largest subunit, RPB1, at specific residues. A variety of techniques exist to identify and quantify the degree of CTD phosphorylation, including phosphorylation-specific antibodies and mass spectrometry. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) have been utilized since the discovery of CTD phosphorylation and continue to represent a simple, direct, and widely applicable approach for qualitatively monitoring CTD phosphorylation. We present a standardized method for EMSA analysis of recombinant GST-CTD ...
[摘要] [摘要 ] 真核RNA聚合酶II转录所有编码蛋白质的mRNA，并且受到高度调节。指导RNA聚合酶II并促进mRNA的共转录加工的关键机制是其高度重复的羧基末端结构域（CTD）的磷酸化。最大的亚基RPB1位于特定残基。存在多种鉴定和定量CTD磷酸化程度的技术，包括磷酸化特异性抗体和质谱法。自发现CTD磷酸化和本文提出了一种标准化的方法，用于EMSA分析被多种CTD激酶磷酸化的重组GST-CTD底物的EMSA方法，以及在变性/还原和还原条件下分析样品的策略。提供了半本地条件。此方法表示简单，直接，以及使用分子生物学实验室通用的设备监测重组底物中CTD磷酸化的可重现方法，该设备可轻松应用于下游分析，包括免疫印迹和质谱分析。
[背景 ] 真核生物RNA聚合酶II（RNAPII）产生所有蛋白质编码的mRNA，小核，小核仁，和许多微小RNA （杰罗尼莫等，2013;梅菲尔德。等，2016） 。各种机制中规范RNAPII活动要赋予特异性基因表达和促进生物处理工艺。在这些是直接翻译后修饰中RNAPII自己在形式的磷酸化（梅菲尔德等，2016） ，脯氨酰异构（梅菲尔德等，2015） ，甲基化（迪亚斯等人，2015年）和乙酰化（交银施罗德等，2013） 。一些研究最多的修饰是磷酸化的C端结构域RNAPII最大的亚基RPB1中（CTD） ...
|
|
|