| Antimicrobial Sensitivity Assay for Bdellovibrio bacteriovorus
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Bdellovibrio bacteriovorus, an obligate predatory bacterium [i.e., bacteria that kill and feed on other bacteria (prey)], has the potential to be used as a probiotic for the disinfection of surfaces or for the treatment of bacterial infections. One option is to use this organism in combination with antimicrobials to potentiate the effectiveness of treatments. In order to make this approach feasible more has to be known about the ability of B. bacteriovorus to resist antibiotics itself. Standard assays to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) are not suitable for B. bacteriovorus, since the small size of this bacterium (0.25-0.35 by 0.5-2 μm) prevents scattering at OD600. Since these predatory bacteria require larger prey bacteria for growth (e.g., E. coli dimensions are ...
[摘要] [摘要]蛭弧菌弧菌，一种专性捕食细菌[即，细菌杀灭和进料的其它细菌（猎物）] ，有可能使被用作表面的消毒益生菌或细菌感染的治疗。一种选择是将这种生物体与抗菌素联合使用以增强治疗效果。为了使该方法可行，必须进一步了解细菌噬菌芽孢杆菌自身抵抗抗生素的能力。标准测定法来确定最小抑制浓度（MIC）是不适合B.弧菌，由于 的小尺寸该细菌（0.25-0.35由0.5-2的微米）防止在OD散射600 。由于这些细菌掠夺需要用于生长较大的捕食的细菌（例如，大肠杆菌（E.coli）尺寸为1由1-2微米），第这里描述的用于抗微生物敏感性测定方法E基础是OD的降低600期间引起的猎物裂解增长。以前关于掠食性细菌对抗菌素耐药性的研究采用的方法无法直接将抗菌素耐药性水平与其他细菌种类进行比较。在这里，我们描述了一种确定细菌对芽孢杆菌的抗药性的方法，该方法可与被测试的参照生物体尽可能接近相同的实验条件进行比较。简要地说，最低抑菌浓度（MIC）值的B.弧菌通过在存在和不存在不同浓度的抗微生物剂的混合捕食者/猎物培养物的600nm处测量的吸光度的减少来确定。值得注意的是，可以使用不同的条件，猎物细菌和/或抗菌剂来修改此方法以获得其他掠食性细菌的抗菌素MIC值。
[背景]噬菌蛭弧菌是一种革兰氏阴性细菌掠夺是“早”在其他革兰氏阴性细菌的物种，生长在他们的牺牲，并最终杀死它们。细菌噬菌芽孢杆菌以及其他掠食性细菌有潜力用作益生菌以消毒表面或治疗细菌感染（Tyson和Elizabeth ...
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| Dual sgRNA-based Targeted Deletion of Large Genomic Regions and Isolation of Heritable Cas9-free Mutants in Arabidopsis
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] CRISPR/Cas9 system directed by a gene-specific single guide RNA (sgRNA) is an effective tool for genome editing such as deletions of few bases in coding genes. However, targeted deletion of larger regions generate loss-of-function alleles that offer a straightforward starting point for functional dissections of genomic loci. We present an easy-to-use strategy including a fast cloning dual-sgRNA vector linked to efficient isolation of heritable Cas9-free genomic deletions to rapidly and cost-effectively generate a targeted heritable genome deletion. This step-by-step protocol includes gRNA design, cloning strategy and mutation detection for Arabidopsis and may be adapted for other plant species.
[摘要] [摘要] CRISPR/Cas9由基因特异性单导RNA（sgRNA）引导的系统是一种有效的基因组编辑工具，如编码基因中少部分碱基的删除。然而，大区域的靶向缺失产生功能缺失等位基因，这为基因组基因座的功能解剖提供了一个直接的起点。我们提出了一个简单易用的策略，包括一个快速克隆双sgRNA载体，有效分离可遗传的Cas9游离基因组缺失，以快速且经济有效地产生靶向遗传基因组缺失。该方法包括拟南芥的gRNA设计、克隆策略和突变检测，可适用于其他植物。
[背景] ...
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| Electrophoretic Mobility Shift Assay of in vitro Phosphorylated RNA Polymerase II Carboxyl-terminal Domain Substrates
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Eukaryotic RNA polymerase II transcribes all protein-coding mRNAs and is highly regulated. A key mechanism directing RNA polymerase II and facilitating the co-transcriptional processing of mRNAs is the phosphorylation of its highly repetitive carboxyl-terminal domain (CTD) of its largest subunit, RPB1, at specific residues. A variety of techniques exist to identify and quantify the degree of CTD phosphorylation, including phosphorylation-specific antibodies and mass spectrometry. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) have been utilized since the discovery of CTD phosphorylation and continue to represent a simple, direct, and widely applicable approach for qualitatively monitoring CTD phosphorylation. We present a standardized method for EMSA analysis of recombinant GST-CTD ...
[摘要] [摘要 ] 真核RNA聚合酶II转录所有编码蛋白质的mRNA，并且受到高度调节。指导RNA聚合酶II并促进mRNA的共转录加工的关键机制是其高度重复的羧基末端结构域（CTD）的磷酸化。最大的亚基RPB1位于特定残基。存在多种鉴定和定量CTD磷酸化程度的技术，包括磷酸化特异性抗体和质谱法。自发现CTD磷酸化和本文提出了一种标准化的方法，用于EMSA分析被多种CTD激酶磷酸化的重组GST-CTD底物的EMSA方法，以及在变性/还原和还原条件下分析样品的策略。提供了半本地条件。此方法表示简单，直接，以及使用分子生物学实验室通用的设备监测重组底物中CTD磷酸化的可重现方法，该设备可轻松应用于下游分析，包括免疫印迹和质谱分析。
[背景 ] 真核生物RNA聚合酶II（RNAPII）产生所有蛋白质编码的mRNA，小核，小核仁，和许多微小RNA （杰罗尼莫等，2013;梅菲尔德。等，2016） 。各种机制中规范RNAPII活动要赋予特异性基因表达和促进生物处理工艺。在这些是直接翻译后修饰中RNAPII自己在形式的磷酸化（梅菲尔德等，2016） ，脯氨酰异构（梅菲尔德等，2015） ，甲基化（迪亚斯等人，2015年）和乙酰化（交银施罗德等，2013） 。一些研究最多的修饰是磷酸化的C端结构域RNAPII最大的亚基RPB1中（CTD） ...
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