| Expression and Purification of Arabidopsis Transmembrane Protein BCM1 in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Heterologous expression and purification of transmembrane proteins have remained a challenge for decades hampering detailed biochemical and structural characterization of key enzymes and their interacting regulators in multiple metabolic pathways. An in-depth study on the newly identified Arabidopsis thaliana integral membrane protein BALANCE OF CHLOROPHYLL METABOLISM 1 (BCM1) showed a stimulatory effect of the BCM1 on magnesium chelatase, the first enzyme of chlorophyll biosynthesis, through interaction with the GENOMES UNCOUPLED 4 (Wang et al., 2020). Here, we report a detailed and optimized method for heterologous expression and purification of His-tagged BCM1 in Saccharomyces cerevisiae. Following this method, we obtained native BCM1 used for in vitro ...
[摘要] [摘要 ] 异源表达和公顷跨膜蛋白的纯化VE 仍然几十年来阻碍了关键酶详述生物化学和结构表征一个挑战小号和它们的相互作用调节在多个代谢途径。上新鉴定进行了深入的研究拟南芥拟南芥叶绿素代谢1（BCM1）的整合膜蛋白BALANCE显示一个通过与相互作用对镁螯合，叶绿素生物合成的第一个酶，所述BCM1的刺激效应基因组中脱开4 （王等等人，2020）。这里 ，我们报告了酿酒酵母中His-tagged BCM1异源表达和纯化的详细和优化方法。˚F ollowing这种方法，我们获得用于本机BCM1 体外酶测定的镁螯合（王等人，2020） 。目前，BCM1的结晶研究正在进行中。这个协议可以适于纯化BCM 1一样从用于酶和结构研究真核生物的跨膜蛋白。
[背景 ] 鉴定翻译后单组的lators其指导LY 调制enzym 一个叶绿素合成的酶的抽动活动可以大大提高我们理解的分子机制，通过该植物保持高效叶绿素叶期间LL合成绿化（Brzezowski 等人，2015年）。然而，叶绿素合成酶及其相互作用蛋白的详细生化分析受到体外重组蛋白可用性的限制。我们最近发现一个叶绿素代谢1（BCM1）的翻译后调节平衡，同时刺激小号叶绿素合成和延迟叶绿素分解，日ERE 被授予叶发育过程中的叶绿素稳态（王等人，2020年）。为了检查BCM1对镁螯合酶（MgCh ...
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| Electrophoretic Mobility Shift Assay of in vitro Phosphorylated RNA Polymerase II Carboxyl-terminal Domain Substrates
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Eukaryotic RNA polymerase II transcribes all protein-coding mRNAs and is highly regulated. A key mechanism directing RNA polymerase II and facilitating the co-transcriptional processing of mRNAs is the phosphorylation of its highly repetitive carboxyl-terminal domain (CTD) of its largest subunit, RPB1, at specific residues. A variety of techniques exist to identify and quantify the degree of CTD phosphorylation, including phosphorylation-specific antibodies and mass spectrometry. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) have been utilized since the discovery of CTD phosphorylation and continue to represent a simple, direct, and widely applicable approach for qualitatively monitoring CTD phosphorylation. We present a standardized method for EMSA analysis of recombinant GST-CTD ...
[摘要] [摘要 ] 真核RNA聚合酶II转录所有编码蛋白质的mRNA，并且受到高度调节。指导RNA聚合酶II并促进mRNA的共转录加工的关键机制是其高度重复的羧基末端结构域（CTD）的磷酸化。最大的亚基RPB1位于特定残基。存在多种鉴定和定量CTD磷酸化程度的技术，包括磷酸化特异性抗体和质谱法。自发现CTD磷酸化和本文提出了一种标准化的方法，用于EMSA分析被多种CTD激酶磷酸化的重组GST-CTD底物的EMSA方法，以及在变性/还原和还原条件下分析样品的策略。提供了半本地条件。此方法表示简单，直接，以及使用分子生物学实验室通用的设备监测重组底物中CTD磷酸化的可重现方法，该设备可轻松应用于下游分析，包括免疫印迹和质谱分析。
[背景 ] 真核生物RNA聚合酶II（RNAPII）产生所有蛋白质编码的mRNA，小核，小核仁，和许多微小RNA （杰罗尼莫等，2013;梅菲尔德。等，2016） 。各种机制中规范RNAPII活动要赋予特异性基因表达和促进生物处理工艺。在这些是直接翻译后修饰中RNAPII自己在形式的磷酸化（梅菲尔德等，2016） ，脯氨酰异构（梅菲尔德等，2015） ，甲基化（迪亚斯等人，2015年）和乙酰化（交银施罗德等，2013） 。一些研究最多的修饰是磷酸化的C端结构域RNAPII最大的亚基RPB1中（CTD） ...
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