| Heterologous Expression and Purification of SARS-CoV2 Nucleocapsid Protein
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] This protocol describes a step by step method for heterologous expression of SARS-CoV2 Nucleocapsid (N) protein in Escherichia coli. Moreover, this protocol includes steps to purify the N protein to high purity and homogeneity. Thus, purified protein can be used for ligand binding assays and other biochemical experiments.
[摘要] [摘要]该方案描述了一种逐步在大肠杆菌中异源表达SARS-CoV2核衣壳（N）蛋白的方法。此外，该方案包括纯化N蛋白以获得高纯度和均一性的步骤。因此，纯化后的蛋白质可用于配体结合分析和其他生化实验。
[] 自2019年底在中国武汉姆被发现以来，SARS-CoV2感染在世界各地肆虐（Wu等人，2020年）。为了跟踪早期感染的进程，在血清学检测中，核衣壳蛋白（N）与棘突蛋白（S）一起用于监测纽约地区早期感染的进程。N是病毒蛋白中最高表达的一种，因此是一个很好的靶点。为了便于这些分析，我们开发了一个纯化方案，并成功地用于这些研究。
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| Preparation, FPLC Purification and LC-FT-ICR-MS of Proteins
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] High magnetic field Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometers provide extremely high mass resolution (resolving power of ~200,000 at 400 m/z) protein detection across a broad mass range, enabling analysis of fine structure of isotopic peak clusters that is missed in other types of mass spectrometers. The protocol detailed here describes preparation of cellular extracts for purification of DNA-binding proteins using multiple chromatographic chemistries via fast protein liquid chromatography (FPLC), and identification and quantitation of the protein isoforms and their post-translational modifications by liquid chromatography coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC-FT-ICR-MS). This protocol benefits from selectively purifying ...
[摘要] [摘要] 高磁场傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪可在较宽的质量范围内提供极高的质量分辨率（在400 m / z处的分辨力约为200,000），可对同位素峰簇的精细结构进行分析在其他类型的质谱仪中被遗漏了。此处详细介绍的协议描述了使用多种色谱化学方法通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）制备用于纯化DNA结合蛋白的细胞提取物的方法，以及通过液相色谱与傅立叶变换耦合对蛋白质同工型及其翻译后修饰的鉴定和定量离子回旋共振质谱（LC-FT-ICR-MS）。该协议受益于通过高分辨率FT-ICR选择性纯化蛋白质以进行鉴定和定量的方法，该技术具有确定性地区分乙酰化和三甲基化翻译后修饰（PTM）添加的能力。
[背景 ] 蛋白质翻译后修饰（翻译后修饰）的细胞过程和功能的调控中发挥非常重要的作用。由于大量潜在的修饰和可以修饰的氨基酸残基数量，PTM的表征具有挑战性。对于蛋白水解位点数量有限，无法以蛋白水解消化形式进行分析且需要完整的蛋白MS分析的蛋白质而言，尤其如此。为实现此目标，该方案描述了通过HPLC分离蛋白质和高精度/高分辨率质谱的方法。HPLC分离至：1 ）从目标蛋白质中消除各种盐和其他干扰分子，2 ）分离蛋白质的各种PTM亚型，3 ...
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| In vitro RNA Cleavage Assays to Characterize IRE1-dependent RNA Decay
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Author:
Date:
2019-07-20
[Abstract] The kinase/RNase IRE1 is a key effector of the cellular response to endoplasmic reticulum stress. The RNase activity of IRE1 can be measured in cells or in the test tube. Here we describe a protocol for the in vitro cleavage and analysis of RNA substrates of IRE1. The method consists of the in vitro transcription, purification and re-folding of IRE1 substrate RNAs followed by their cleavage using recombinant cytosolic kinase/RNase domains of IRE1 and the separation of the resulting fragments by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. This protocol allows the study of the cleavage kinetics of IRE1’s RNA substrates in vitro.
[摘要] IRE1的RNase活性是细胞对内质网应激反应的关键效应物.IRE1的RNase活性可以在细胞或试管中测量。这里我们描述了体外方案 IRE1的RNA底物的切割和分析。该方法包括IRE1底物RNA的体外转录，纯化和再折叠，然后使用IRE1的细胞毒性激酶/ RNase结构域进行切割和分离。 该方案允许通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳研究所得片段的IRe1 RNA底物的裂解动力学。
【背景】内质网（ER）中未（错）折叠蛋白的积累导致ER应激并激活未折叠蛋白反应（UPR），这是一种维持ER稳态的适应性机制（综述于Karagöz等人， 2019）.IRE1，一种具有胞质激酶和RNase活性的跨膜ER应激传感器/换能器，是最保守的UPR信号臂，它是从酵母到后生动物的发现（Mori，2009）.ER应激导致IRE1 IRE1以两种方式保留ER稳态。首先，通过其研究最多的机制，IRE1的RNase结构域切割 XBP1 mRNA中发现的内含子以启动非常规剪接事件激活转录因子 XBP1 （Yoshida et al。，2001; Calfon et al。。，2002; Peschek et al 。，2015）。活性XBP1S（剪接的“S”）控制基因的上调，提高蛋白质加工能力o ER（Lee et al。， 2003; Acosta-Alvear et ...
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