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Author:
Date:
2019-09-20
[Abstract] In comparison with full-length IgGs, antigen binding fragments (Fabs) are smaller in size and do not require the complexed post-translational modification. Therefore, Fab can be cost-effectively produced using an Escherichia coli (E. coli) expression system. However, the disulfide-bonds containing exogenous protein, including Fab, tend to form insoluble inclusion bodies in E. coli, which has been the bottleneck for exogenous protein expressions using this system. The secretory expression of proteins in periplasm or extracellular medium are promising strategies to prevent the formation of inclusion bodies to improve the efficiency to produce Fabs from E. coli. The extracellular expression is of particularly interest since it releases the product into ...
[摘要] 与全长igg相比，抗原结合片段（fab）较小，不需要复杂的翻译后修饰。因此，用E.E.E.E.大肠杆菌（大肠杆菌）表达体系可以有效地生产Fab。然而，含有外源蛋白的二硫键（包括fab）往往在大肠杆菌中形成不溶性包涵体，成为该系统表达外源蛋白的瓶颈。蛋白质在胞外或周质中的分泌表达是防止包涵体形成、提高大肠杆菌生产fabs效率的有效途径。细胞外表达特别有趣，因为它将产物释放到培养基中，而周质表达的产量仅限于周质空间。此外，细胞外表达可以直接从培养上清液中提取蛋白质，省去细胞裂解过程，减少宿主细胞蛋白质或dna的污染。以抗vegf-fab为例，我们提供了一个基于碱性磷酸酶（phoa）启动子和热稳定肠毒素ii（stii）先导序列的方案。利用磷酸饥饿诱导fabs的分泌表达，该方法可普遍用于fabs的高效生产。
【背景】大肠杆菌具有遗传背景清晰、操作简便、生产成本低廉等优点，被广泛应用于外源基因的表达，尤其是分子量低、构象结构简单的外源基因的表达（Gupta和Shukla，2017）。外源蛋白在大肠杆菌中的表达主要分为包涵体表达、胞内可溶性表达和胞外分泌三类（Jalaliard，2013；Gupta and ...
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] The cyclic-nucleotide modulated ion channel family includes cyclic nucleotide-gated (CNG) and hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-modulated (HCN) channels, which play essential roles in visual and olfactory signaling and the heart pacemaking activity. Functionally, these channels have been extensively characterized by electrophysiological techniques from protein heterologously expressed in Xenopus oocytes and mammalian cells. On the other hand, expression and purification of these proteins for biophysical and structural analyses in vitro is problematic and expensive and, accordingly, only limited information on the purified channels is available in the literature. Here we describe a protocol for binding studies of fluorescently labeled cyclic nucleotides to a ...
[摘要] 环核苷酸调节的离子通道家族包括环核苷酸门控（CNG）和超极化激活和环核苷酸调节（HCN）通道，其在视觉和嗅觉信号传导和心脏起搏活动中起重要作用。在功能上，这些通道已经通过来自非洲爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞中异源表达的蛋白质的电生理学技术进行了广泛的表征。另一方面，这些蛋白质的表达和纯化用于体外生物物理和结构分析是有问题且昂贵的，因此，文献中仅提供关于纯化通道的有限信息。在这里，我们描述了用于将荧光标记的环核苷酸与真核CNG通道的同源物结合研究的方案。此外，我们描述了如何在竞争测定中直接探测未标记的环核苷酸的结合。使用荧光作为配体结合的灵敏探针可减少所需蛋白质的量，并使用标准实验室设备进行快速简便的测量。
【背景】了解蛋白质在分子细节中的功能需要广泛的微观表征。对于配体门控离子通道，需要进行不同的分析以获得有关蛋白质与配体的特异性相互作用，配体结合位点和孔隙之间的通信以及通道特异性特征（如离子通量和失活或脱敏）的信息。属性。与对应于各种功能状态的通道构象的结构数据一起，这允许开发通道功能和调节的完整机械描述。环核苷酸门控（CNG）离子通道是四聚体钾通道，由于它们在嗅觉和视觉信号级联中的功能而特别受关注（Kaupp和Seifert，2002; Craven和Zagotta，2006）。然而，在确定的条件下，纯化的CNG通道的数据非常有限，主要来自单分子力谱（Higgins ...
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