| Ex vivo Assessment of Mitochondrial Function in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using XF Analyzer
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Cellular health and function, as we know today, depend on a large extent on mitochondrial function. The essential function of mitochondria is the energy production, more precisely ATP production, via oxidative phosphorylation. Mitochondrial energy production parameters therefore represent important biomarkers. Studies on human cells have mainly been performed on in vitro cell cultures. However, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are particularly suitable for such examinations. That’s why this protocol describes a method to measure key parameters of mitochondrial function in freshly isolated PBMCs with the latest technology, the XF Analyzer. For this ex vivo approach PBMCs are first isolated out of human anticoagulated blood. Next, they are attached to the surface of special ...
[摘要] [摘要]正如我们今天所知，细胞的健康和功能在很大程度上取决于线粒体的功能。线粒体的基本功能是ENER GY生产，更精确的LY ATP生产，通过氧化磷酸化。因此，线粒体能量产生参数代表重要的生物标记。对人类细胞的研究主要是在体外细胞培养中进行的。然而，外周血单核细胞（PBMC）是特别升ý适于这样的检查。这就是为什么这个协议描述测量与最新的技术，新鲜分离的PBMC线粒体功能的关键参数的方法的XF分析。对于这个离体PBMC首先是从人抗凝血液中分离出来的。接下来，将它们附着到预先涂有Poly-D-Lysine的特殊微孔板的表面上。期间的氧消耗速率（OCR）以及细胞外酸化率（ECAR）的应力试剂寡，羰氰化物随后的测量4 - （三氟甲氧基）苯腙（FCCP），鱼藤酮和抗霉素A被注入。可以从获得的结果中计算出几个线粒体参数。该协议的应用允许分析对人体细胞的各种影响，例如药物或环境因素。
[背景]线粒体在维持正常细胞功能中起关键作用。现在众所周知，它们不仅通过氧化磷酸化产生ATP，而且还参与氨基酸，脂质和核苷酸的代谢，潜水信号转导和氧化还原过程以及质量控制和降解过程，包括线粒体和磷酸化。细胞凋亡（Pfanner等，2019）。然而，线粒体代表正常细胞中ATP合成的主要位点（Akbari等人，2019）。为此，通过多亚基酶复合物I – ...
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| A Versatile Protocol to Quantify BCR-mediated Phosphorylation in Human and Murine B Cell Subpopulations
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Signal transduction is the process by which molecular signals are transmitted from the cell surface to its interior, resulting in functional changes inside the cell. B cell receptor (BCR) signaling is of crucial importance for B cells, as it regulates their differentiation, selection, survival, cellular activation and proliferation. Upon BCR engagement by antigen several protein kinases, lipases and linker molecules become phosphorylated. Phosphoflow cytometry (phosphoflow) is a flow cytometry-based method allowing for analysis of protein phosphorylation in single cells. Due to recent advances in methodology and antibody availability – together with the relatively easy quantification of phosphorylation – phosphoflow is increasingly and more commonly used, compared to classical ...
[摘要] [背景] 信号转导是分子信号从细胞表面传递到细胞内部的过程，导致细胞内部功能发生变化。B细胞受体（BCR）信号对于B细胞至关重要，因为它调节了它们的分化，选择，存活，细胞活化和增殖。抗原与BCR结合后，一些蛋白激酶，脂肪酶和接头分子会被磷酸化。磷酸流式细胞仪（phosphoflow）是一种基于流式细胞仪的方法，可以分析单个细胞中的蛋白质磷酸化。由于方法学和抗体的可获得性的最新进展，再加上相对容易的磷酸化定量，与传统的蛋白质印迹分析相比，越来越多地使用磷酸流。但是，建立一种适用于所有感兴趣目标的方法可能具有挑战性。在这里，我们提出了逐步的磷流方案，允许对信号分子的磷酸化状态进行评估，并进行广泛的染色，以鉴定各种人和鼠B细胞亚群，如先前在Rip等人的原始论文。，（2020 ）。在原始论文中对磷流靶标的描述旁边，我们提供了在BCR信号传导中起关键作用的其他靶标的指导。循序渐进的磷酸流操作流程是用户友好的操作，可对人和鼠B细胞亚群中各种BCR信号分子的磷酸化进行灵敏检测。
[背景] ...
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| Methodology for in vitro Assessment of Human T Cell Activation and Blockade
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] Methods to test both the functionality and mechanism of action for human recombinant proteins and antibodies in vitro have been limited by multiple factors. To test the functionality of a recombinant protein or antibody, the receptor, the receptor-associated ligand, or both must be expressed by the cells present within the in vitro culture. While the use of transfected cell lines can circumvent this gap, the use of transfected cell lines does not allow for studying the native signaling pathway(s) modulated by the specific recombinant protein or antibody in primary cells. The present protocol utilizes sort purified CD14+ monocytes and T cells, both CD4+ T cells and CD8+ T cells, from healthy donors in a co-culture system. This methodology ...
[摘要] [摘要 ] 在体外测试人重组蛋白和抗体的功能和作用机理的方法受到多种因素的限制。要测试重组蛋白或抗体的功能，是受体，受体相关配体或两者它必须由体外培养物中存在的细胞表达，尽管使用转染的细胞系可以规避这一差距，但使用转染的细胞系并不能研究由特定重组蛋白或重组蛋白调控的天然信号通路（S）。抗体原代细胞，本协议利用排序纯化的CD14 Tasu 单核细胞和T细胞，这两种CD4 Tasu T细胞和CD8 Tasu T细胞，从他ALTH Ÿ 的捐助方共培养体系。这种方法特别相关的测试重组镨大肠菌素或抗体，是用于治疗自身免疫性疾病和癌症的推定疗法。目前的研究方案着重于含有B7-H4表达蛋白的共培养物 上皮细胞加上自体CD4 + T细胞或CD8 + T细胞，可以根据用户的特定需求修改方案。
背景 ] 临床使用检查点抑制剂治疗的，例如，抗CTLA-4和抗PD-1，已被证明可用作癌症治疗以增强抗肿瘤的免疫应答（柯伦等人，2010; 顾彬等等人，2014年），尽管在一线治疗失败的患者中获得成功，但仅约20％的接受治疗的患者对检查点抑制剂抗体治疗产生了反应，这种对患者无效的治疗可能是多因素的，也可能反映了特定类型。患者向临床医生提出的癌症（ Podojil等人，2020）。肿瘤细胞中存在的肿瘤细胞和单核细胞/巨噬细胞表达B7- ...
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