| Quantification of the Surface Expression of G Protein-coupled Receptors Using Intact Live-cell Radioligand Binding Assays
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] G protein-coupled receptors (GPCRs) are the most structurally diverse family of signaling proteins and regulate a variety of cell function. For most GPCRs, the cell surface is their functional destination where they are able to respond a wide range of extracellular stimuli, leading to the activation of intracellular signal transduction cascades. Thus, the quantity of receptor expression at the cell surface is a crucial factor regulating the functionality of the receptors. Over the past decades, many methods have been developed to measure the cell surface expression of GPCRs. Here, we describe an intact live-cell radioligand binding assay to quantify the surface expression of GPCRs at the endogenous levels or after overexpression. In this assay, cell cultures will be incubated with ...
[摘要] [摘要] G蛋白偶联受体（GPCR）是信号蛋白中结构最多样化的家族，可调节多种细胞功能。对于大多数GPCR，细胞表面是它们的功能目的地，能够响应广泛的细胞外刺激，从而激活细胞内信号转导级联反应。因此，受体在细胞表面的表达量是调节受体功能的关键因素。在过去的几十年中，已开发出许多方法来测量GPCR的细胞表面表达。在这里，我们描述了完整的活细胞放射性配体结合测定法，以量化内源水平或过表达后GPCR的表面表达。在该测定中，将细胞培养物与特定的细胞不可渗透的放射性配体温育，所述放射性不可配体选择性地和化学计量地结合至各个GPCR，并且通过受体结合的配体的放射性来定量细胞表面的受体数量。 此方法对于测量完整活细胞表面的功能性GPCR具有高度特异性，对于内源性，低丰度的GPCR特别有用。
[背景 ] G蛋白偶联受体（GPCR）构成细胞表面受体的最大超家族，并在生理和病理条件下调节多种细胞功能（Hauser 等人，2017; Hilger 等人，2018; Weinberg和Puthenveedu，2019） ...
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| FRET Reporter Assays for cAMP and Calcium in a 96-well Format Using Genetically Encoded Biosensors Expressed in Living Cells
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] Stimulation of G protein-coupled receptors (GPCR) by hormones and neurotransmitters elicits cellular responses, many of which result from alterations in the concentrations of cytosolic cAMP and Ca2+. Here, we describe a microplate reader fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay that uses the genetically encoded biosensors H188 and YC3.60 so that it is possible to monitor the kinetics with which alterations of [cAMP] or [Ca2+] occur in monolayers or suspensions of living cells exposed to GPCR agonists. This protocol uses HEK293 cell lines doubly transfected with a FRET biosensor and a recombinant GPCR of interest (e.g., glucagon receptors, CCK2 receptors, or NPY2R receptors). The protocol allows for rapid screening of small molecule GPCR ...
[摘要] [摘要] 激素和神经递质刺激G蛋白偶联受体（GPCR）引起细胞反应，其中许多是由于胞质cAMP和Ca 2+ 浓度的变化所致。在这里，我们描述了酶标仪的荧光共振能量转移使用遗传编码的生物传感器H188和YC3.60进行FRET）分析，从而可以监测暴露于GPCR激动剂的活细胞的单层或悬浮液中[cAMP]或[Ca 2+ ]发生变化的动力学。该协议使用FRET 生物传感器和感兴趣的重组GPCR 双重转染的HEK293细胞系（例如 ，胰高血糖素受体，CCK 2 受体或NPY2R受体）。该方案可快速筛选小分子GPCR 激动剂和拮抗剂，它还可用于发现具有GPCR活化作用的合成单，双和三激动肽。属性。
[背景] 活细胞荧光共振能量转移（FRET）分析结合显微镜和数字成像技术通常用于监测cAMP和Ca 2+的水平响应GPCR激动剂刺激而波动的动力学。另一种不使用显微镜的方法，而是使用自动荧光分光光度计和活细胞的单层或悬浮液，以96孔格式基于FRET的cAMP和Ca 2+ 的检测。该方案使用基因编码的生物传感器，以实现平均动力学可以在已知浓度应用GPCR激动剂的条件下，使用酶标仪实时获得药理研究数据。这些FRET分析使用稳定表达cAMP生物传感器H188（Klarenbeek 等人，2015 ）或Ca的细胞系2+ 生物传感器YC3.60（Nagai ...
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