| Quantitative Kinetic Analyses of Histone Turnover Using Imaging and Flow Cytometry
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Dynamic histone changes occur as a central part of chromatin regulation. Deposition of histone variants and post-translational modifications of histones are strongly associated with properties of chromatin status. Characterizing the kinetics of histone variants allows important insights into transcription regulation, chromatin maintenance and other chromatin properties. Here we provide a protocol of quantitative and sensitive approaches to test the timing of incorporation and dissociation of histones using a two-color SNAP-labeling system, labelling pre-existing and newly-incorporated histones distinctly. Together with cell cycle synchronization methods and cell cycle markers, this approach enables a pulse-chase analysis to determine the turnover of histone variants during the cell cycle, ...
[摘要] [摘要] 动态的组蛋白变化是染色质调节的核心部分。组蛋白变体的沉积和组蛋白的翻译后修饰与染色质状态的属性密切相关。表征组蛋白变体的动力学特性可为深入了解转录调控，染色质维持和其他染色质特性提供重要信息。在这里，我们提供了一种定量和敏感方法的协议，以使用双色SNAP标记系统测试组蛋白的结合和解离时间，分别标记预先存在的和新结合的组蛋白。结合细胞周期同步方法和细胞周期标志物，这种方法可以进行脉冲追踪分析，以确定在细胞周期内使用成像或流式细胞仪方法以单细胞分辨率检测到的组蛋白变体的周转率。除了测试整体组蛋白更新，还可以使用成像方法解决组蛋白变体的细胞周期依赖性细胞定位。
[背景] 染色质重塑是真核细胞众多基本细胞活动的一部分（Geiman 和Robertson，2002；Clapier 和Cairns ，2009）。转录因子和RNA聚合酶的可及性通常与DNA甲基化和染色质状态的变化相关，包括可及性，翻译后的组蛋白修饰和组蛋白变体的沉积。组蛋白变体差异性地调节调节发育，细胞分化或其他生理活动的基因表达（Banaszynski 等，2010）。它们在DNA修复，端粒维护，异染色质形成和染色质分离中也发挥着不同的作用（Henikoff 和Smith，2015； Zink和Hake，2016）。此外，组蛋白变体的掺入失调与癌症有关（Vardabasso et ...
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| FRET Reporter Assays for cAMP and Calcium in a 96-well Format Using Genetically Encoded Biosensors Expressed in Living Cells
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] Stimulation of G protein-coupled receptors (GPCR) by hormones and neurotransmitters elicits cellular responses, many of which result from alterations in the concentrations of cytosolic cAMP and Ca2+. Here, we describe a microplate reader fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay that uses the genetically encoded biosensors H188 and YC3.60 so that it is possible to monitor the kinetics with which alterations of [cAMP] or [Ca2+] occur in monolayers or suspensions of living cells exposed to GPCR agonists. This protocol uses HEK293 cell lines doubly transfected with a FRET biosensor and a recombinant GPCR of interest (e.g., glucagon receptors, CCK2 receptors, or NPY2R receptors). The protocol allows for rapid screening of small molecule GPCR ...
[摘要] [摘要] 激素和神经递质刺激G蛋白偶联受体（GPCR）引起细胞反应，其中许多是由于胞质cAMP和Ca 2+ 浓度的变化所致。在这里，我们描述了酶标仪的荧光共振能量转移使用遗传编码的生物传感器H188和YC3.60进行FRET）分析，从而可以监测暴露于GPCR激动剂的活细胞的单层或悬浮液中[cAMP]或[Ca 2+ ]发生变化的动力学。该协议使用FRET 生物传感器和感兴趣的重组GPCR 双重转染的HEK293细胞系（例如 ，胰高血糖素受体，CCK 2 受体或NPY2R受体）。该方案可快速筛选小分子GPCR 激动剂和拮抗剂，它还可用于发现具有GPCR活化作用的合成单，双和三激动肽。属性。
[背景] 活细胞荧光共振能量转移（FRET）分析结合显微镜和数字成像技术通常用于监测cAMP和Ca 2+的水平响应GPCR激动剂刺激而波动的动力学。另一种不使用显微镜的方法，而是使用自动荧光分光光度计和活细胞的单层或悬浮液，以96孔格式基于FRET的cAMP和Ca 2+ 的检测。该方案使用基因编码的生物传感器，以实现平均动力学可以在已知浓度应用GPCR激动剂的条件下，使用酶标仪实时获得药理研究数据。这些FRET分析使用稳定表达cAMP生物传感器H188（Klarenbeek 等人，2015 ）或Ca的细胞系2+ 生物传感器YC3.60（Nagai ...
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