| Extracellular RNA Isolation from Biofilm Matrix of Pseudomonas aeruginosa
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Most bacteria in natural ecosystems form biofilms-a bacterial community, surrounded by a polymer matrix that consists mostly of exopolysaccharides, proteins, and nucleic acids. Extracellular RNA as a matrix component is involved in biofilm formation-the fact that was confirmed by direct detection of extracellular RNA in the biofilm matrix, and by an interruption of the biofilm's structure with RNases. Number of protocols describing isolation of RNA from biofilm matrix are limited and usually involve uncommon equipment and reagents. Here we describe simple method for extracellular RNA isolation from biofilm matrix using basic laboratory reagent and equipment. Key steps of the protocol include separation of matrix and bacterial cells with high ionic solution of NaCl, RNA precipitation with ...
[摘要] [摘要]自然生态系统中的大多数细菌形成生物膜 –一个细菌群落，周围环绕着聚合物基质，该基质主要由胞外多糖，蛋白质和核酸组成。细胞外RNA作为基质成分参与生物膜的形成，这一事实已通过直接检测生物膜基质中的细胞外RNA以及通过RNase破坏生物膜结构而得到证实。。描述从生物膜基质中分离RNA的方案数量有限，通常涉及不常见的设备和试剂。在这里，我们描述了使用基本的实验室试剂和设备从生物膜基质分离细胞外RNA的简单方法。该方案的关键步骤包括用高离子浓度的NaCl溶液分离基质和细菌细胞，用LiCl沉淀RNA，并选择使用廉价的色谱柱进行质粒DNA分离，而不是使用专门的RNA试剂盒进行纯化。所描述的方案允许在不到一天的时间内（不包括生物膜生长的时间）分离适用于进一步的分子生物学程序（例如测序，RT-PCR和克隆）的细胞外RNA。
[背景]生物膜基质可抵抗不同的影响（抗菌药物，消毒剂，机械力），并为协调协调不同过程创造了环境（Svenningsen，2018年）。RNA存在于细胞外生物膜基质中，并形成RNA-DNA的主要交联弹性共聚物（Seviour等，2019）。用核糖核酸酶处理生物膜导致生物膜质量的重大损失，并强调了RNA对于维持生物膜完整性的重要性（Lee等人，2019）。同时，RNA在生物膜基质中的来源和作用仍未得到很好的研究。
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| Biochemical Pulldown of mRNAs and Long Noncoding RNAs from Cellular Lysates Coupled with Mass Spectrometry to Identify Protein Binding Partners
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] RNA binding proteins (RBPs) interact with cellular mRNAs, controlling various steps throughout the lifetime of these transcripts, including transcription, cellular transport, subcellular localization, translation and degradation. In addition to binding mRNA transcripts, a growing number of RBPs are shown to bind long noncoding RNAs (lncRNAs), controlling key cellular processes, including gene expression and translation of proteins. Current methodologies aimed at identifying and characterizing protein binding partners of specific RNAs of interest typically rely on tagging of the RNA with affinity aptamers, using in vitro transcribed RNA or immobilized oligonucleotides to capture RNA-protein complexes under native conditions. These assays are coupled with mass spectrometry or ...
[摘要] [摘要] RNA结合蛋白（限制性商业惯例）我Nteract随着细胞mRNA，控制整个这些转录，包括转录，细胞运输，亚细胞定位，翻译和降解。除了寿命结合mRNA转录物，越来越多的各种步骤的限制性商业惯例被证明与长期的非编码RNA（lncRNA ）结合，控制关键的细胞进程，包括基因的表达和蛋白质的翻译。目前旨在鉴定和表征感兴趣的特定RNA的蛋白质结合伴侣的方法主要依靠用亲和适体标记RNA。 ，使用体外转录的RNA或固定的寡核苷酸在天然条件下捕获RNA-蛋白质复合物，这些测定方法与质谱或Western Blot分析相结合，以鉴定或/和确认相互作用的蛋白质。 mRNA和大的长非编码RNA的伴侣。oach依赖于特定靶RNA的生化下拉以及细胞裂解液中相互作用的蛋白伴侣与质谱的结合来鉴定新的相互作用蛋白。通过使用与靶RNA杂交的24-48〜20 mer 生物素化DNA 探针，该方法可确保高特异性和最小限度的脱靶结合。这种方法具有可重现性和快速性，可作为发现研究以鉴定与目标RNA结合的蛋白质的基础。
[背景] RNA结合蛋白（RBP）与细胞中的mRNA相互作用形成核糖核蛋白（RNP）复合物，通过影响转录物的加工，亚细胞定位，翻译和稳定性来调节这些转录物的转录后活性（综述见Lunde 等人。，2007; Glisovic ...
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