| CENP-C Phosphorylation by CDK1 in vitro
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Accurate chromosome segregation during mitosis requires the kinetochore, a large protein complex, which makes a linkage between chromosomes and spindle microtubes. An essential kinetochore component, CENP-C, is phosphorylated by Cyclin-B-Cyclin dependent kinase 1 (CDK1) that is a master kinase for mitotic progression, promoting proper kinetochore assembly during mitosis. Here, we describe an in vitro CDK1 kinase assay to detect CENP-C phosphorylation using Phos-tag SDS-PAGE without radiolabeled ATP. Our protocol has advantages in ease and safety over conventional phosphorylation assays using [γ-32P]-ATP, which has potential hazards despite their better sensitivity. The protocol described here can be applicable to other kinases and be also useful for analysis of phospho-sites in ...
[摘要] [摘要]在有丝分裂过程中，准确的染色体分离需要动线粒体（一种大型蛋白复合物），使染色体与纺锤体微管之间形成联系。必需的线粒体成分CENP-C被细胞周期蛋白B-细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）磷酸化，该激酶是有丝分裂进程的主要激酶，在有丝分裂过程中促进适当的线粒体组装。在这里，我们描述了一种体外CDK1激酶测定法，可使用Phos -tag SDS-PAGE检测CENP-C磷酸化而无放射性ATP 。ø乌尔协议具有使用[γ-在容易且安全优于常规磷酸化试验的优点32 P] -ATP ，其具有潜在危险，尽管其敏感性更高。该协议describ编这里可以适用于其他激酶并且也用于在基板磷酸位点的分析是有用的体外。
[背景]细胞周期蛋白-B细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）是有丝分裂的主要调节剂，其磷酸化许多靶标以确保有丝分裂的进展（Nurse，1990 ; Malumbres and Barbacid ，2005 ）。在有丝分裂期间，携带遗传信息的染色体被平均分为两个子细胞。线粒体是关键的大蛋白复合物，通过在染色体和纺锤体微管之间架桥来确保忠实的染色体分离（Fukagawa和Earnshaw，2014）。组成动线粒的各种蛋白质被CDK1磷酸化（Gascoigne等人，2013; Nishino等人，2013; Hara等人，2018b; ...
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| Biochemical Pulldown of mRNAs and Long Noncoding RNAs from Cellular Lysates Coupled with Mass Spectrometry to Identify Protein Binding Partners
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] RNA binding proteins (RBPs) interact with cellular mRNAs, controlling various steps throughout the lifetime of these transcripts, including transcription, cellular transport, subcellular localization, translation and degradation. In addition to binding mRNA transcripts, a growing number of RBPs are shown to bind long noncoding RNAs (lncRNAs), controlling key cellular processes, including gene expression and translation of proteins. Current methodologies aimed at identifying and characterizing protein binding partners of specific RNAs of interest typically rely on tagging of the RNA with affinity aptamers, using in vitro transcribed RNA or immobilized oligonucleotides to capture RNA-protein complexes under native conditions. These assays are coupled with mass spectrometry or ...
[摘要] [摘要] RNA结合蛋白（限制性商业惯例）我Nteract随着细胞mRNA，控制整个这些转录，包括转录，细胞运输，亚细胞定位，翻译和降解。除了寿命结合mRNA转录物，越来越多的各种步骤的限制性商业惯例被证明与长期的非编码RNA（lncRNA ）结合，控制关键的细胞进程，包括基因的表达和蛋白质的翻译。目前旨在鉴定和表征感兴趣的特定RNA的蛋白质结合伴侣的方法主要依靠用亲和适体标记RNA。 ，使用体外转录的RNA或固定的寡核苷酸在天然条件下捕获RNA-蛋白质复合物，这些测定方法与质谱或Western Blot分析相结合，以鉴定或/和确认相互作用的蛋白质。 mRNA和大的长非编码RNA的伴侣。oach依赖于特定靶RNA的生化下拉以及细胞裂解液中相互作用的蛋白伴侣与质谱的结合来鉴定新的相互作用蛋白。通过使用与靶RNA杂交的24-48〜20 mer 生物素化DNA 探针，该方法可确保高特异性和最小限度的脱靶结合。这种方法具有可重现性和快速性，可作为发现研究以鉴定与目标RNA结合的蛋白质的基础。
[背景] RNA结合蛋白（RBP）与细胞中的mRNA相互作用形成核糖核蛋白（RNP）复合物，通过影响转录物的加工，亚细胞定位，翻译和稳定性来调节这些转录物的转录后活性（综述见Lunde 等人。，2007; Glisovic ...
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