| A One-enzyme RT-qPCR Assay for SARS-CoV-2, and Procedures for Reagent Production
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Given the scale of the ongoing COVID-19 pandemic, the need for reliable, scalable testing, and the likelihood of reagent shortages, especially in resource-poor settings, we have developed an RT-qPCR assay that relies on an alternative to conventional viral reverse transcriptases, a thermostable reverse transcriptase/DNA polymerase (RTX) (Ellefson et al., 2016). Here we show that RTX performs comparably to the other assays sanctioned by the CDC and validated in kit format. We demonstrate two modes of RTX use – (i) dye-based RT-qPCR assays that require only RTX polymerase, and (ii) TaqMan RT-qPCR assays that use a combination of RTX and Taq DNA polymerases (as the RTX exonuclease does not degrade a TaqMan probe). We also provide straightforward recipes for the purification of this ...
[摘要] [摘要]鉴于持续进行的COVID-19大流行的规模，可靠，可扩展的测试需求以及试剂短缺的可能性（尤其是在资源匮乏的环境中），我们开发了一种n RT-qPCR分析方法，该方法依赖于其他方法与常规病毒逆转录酶相比，热稳定的逆转录酶/ DNA聚合酶（RTX）（Ellefson等，2016）。在这里，我们显示RTX与CDC认可并以试剂盒形式验证的其他检测方法具有可比性。我们演示了两种RTX使用模式-（i）仅需要RTX聚合酶的基于染料的RT-qPCR分析，以及（ii）使用RTX和Taq DNA聚合酶组合的TaqMan RT-qPCR分析（因为RTX核酸外切酶不降级ea TaqMan探针）。我们还提供了纯化该替代试剂RTX的简单方法。我们预计，在资源匮乏或需要的地方，研究人员可以获取可用的构建体，并开始开发自己的测定方法，而不论它们存在的调控框架如何。
[背景]尽管已采用多种病毒检测方法来检测SARS-CoV-2感染，包括各种分子诊断和免疫诊断测试，但逆转录酶定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仍然是主要且最敏感的方法SARS-CoV-2检测试验（D'Cruz等，2020 ; Tang等，2020 ）。RT-qPCR的首要地位在很大程度上是因为基于抗体的测试以及快速核酸诊断平台（如Abbott ...
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| Biochemical Pulldown of mRNAs and Long Noncoding RNAs from Cellular Lysates Coupled with Mass Spectrometry to Identify Protein Binding Partners
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] RNA binding proteins (RBPs) interact with cellular mRNAs, controlling various steps throughout the lifetime of these transcripts, including transcription, cellular transport, subcellular localization, translation and degradation. In addition to binding mRNA transcripts, a growing number of RBPs are shown to bind long noncoding RNAs (lncRNAs), controlling key cellular processes, including gene expression and translation of proteins. Current methodologies aimed at identifying and characterizing protein binding partners of specific RNAs of interest typically rely on tagging of the RNA with affinity aptamers, using in vitro transcribed RNA or immobilized oligonucleotides to capture RNA-protein complexes under native conditions. These assays are coupled with mass spectrometry or ...
[摘要] [摘要] RNA结合蛋白（限制性商业惯例）我Nteract随着细胞mRNA，控制整个这些转录，包括转录，细胞运输，亚细胞定位，翻译和降解。除了寿命结合mRNA转录物，越来越多的各种步骤的限制性商业惯例被证明与长期的非编码RNA（lncRNA ）结合，控制关键的细胞进程，包括基因的表达和蛋白质的翻译。目前旨在鉴定和表征感兴趣的特定RNA的蛋白质结合伴侣的方法主要依靠用亲和适体标记RNA。 ，使用体外转录的RNA或固定的寡核苷酸在天然条件下捕获RNA-蛋白质复合物，这些测定方法与质谱或Western Blot分析相结合，以鉴定或/和确认相互作用的蛋白质。 mRNA和大的长非编码RNA的伴侣。oach依赖于特定靶RNA的生化下拉以及细胞裂解液中相互作用的蛋白伴侣与质谱的结合来鉴定新的相互作用蛋白。通过使用与靶RNA杂交的24-48〜20 mer 生物素化DNA 探针，该方法可确保高特异性和最小限度的脱靶结合。这种方法具有可重现性和快速性，可作为发现研究以鉴定与目标RNA结合的蛋白质的基础。
[背景] RNA结合蛋白（RBP）与细胞中的mRNA相互作用形成核糖核蛋白（RNP）复合物，通过影响转录物的加工，亚细胞定位，翻译和稳定性来调节这些转录物的转录后活性（综述见Lunde 等人。，2007; Glisovic ...
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