| Candida albicans Agar Invasion Assays
|
|
Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] The ability of the human fungal pathogen Candida albicans to disseminate into tissues is promoted by a switch from budding to invasive hyphal growth. This morphological transition is stimulated by multiple environmental factors that can vary at different sites of infection. To identify genes that promote invasive growth, C. albicans mutants can be screened for defects in growing invasively into solid agar medium as a substitute for studying tissue invasion. This in vitro approach has advantages in that it permits the media conditions to be varied to mimic different host environments. In addition, the concentration of agar can be varied to determine the effects of altering the rigidity of the matrix into which the cells invade, as this provides a better indicator ...
[摘要] [摘要 ] 人类真菌病原体白色念珠菌传播到组织的能力是由从发芽到侵入性菌丝生长的转换而增强的。多种环境因素可能会刺激这种形态转变，这些环境因素可能在不同的感染部位有所不同。为了鉴定促进侵入growt基因小时，白色念珠菌突变体可以在侵入性生长成固体琼脂培养基作为研究组织侵袭的替代品进行筛选的缺陷。这个体外 该方法的优点在于，它允许改变媒体条件以模仿不同的主机环境。另外，可以改变琼脂的浓度以确定改变细胞侵袭的基质的刚度的作用，因为与液体培养中形成菌丝的能力相比，这提供了更好的侵袭性生长指标。在多种条件下的测试可以用来鉴定具有最强缺陷的突变细胞。因此，将描述用于分析白色念珠菌在不同条件下的侵袭性生长的方案和培养基，其适合于测试突变株白色念珠菌菌株的单个菌株或高通量分析。
[背景 ] 白色念珠菌是一种多形性真菌病原体，可以通过形成芽（小球形细胞），假菌丝细胞（细长细胞链）或菌丝细胞（具有平行平行线的长丝状细胞链）生长（图1）（贵族等人，2017）。已证明宿主中遇到的多种环境刺激可促进向侵袭性生长的转变，包括人体温度（37 °C ），碱性pH，CO 2 ，血清中的因子和糖GlcNAc（N-乙酰氨基葡萄糖） ）（Kornitzer，2019）。萌芽细胞被认为促进胃肠道的血流传播和定植（Pierce和Kumamoto ，2012 ；Witchley ...
|
|
|
| NMR waterLOGSY as An Assay in Drug Development Programmes for Detecting Protein-Ligand Interactions–NMR waterLOGSY
|
|
Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] In drug development programmes, multiple assays are needed for the determination of protein-compound interactions and evaluation of potential use in assays with protein-protein interactions. In this protocol we describe the waterLOGSY NMR method for confirming protein-ligand binding events.
[摘要] [摘要] 在药物开发计划中，需要多种测定方法来测定蛋白质与化合物的相互作用，并评估在蛋白质与蛋白质相互作用中的潜在用途。在此协议中，我们描述了用于确认蛋白质-配体结合事件的waterLOGSY NMR方法。
[背景] 随着在疾病细胞中发现更多的蛋白质形式变化，药物发现计划不断增加，这些计划依赖于使用小分子文库对目标蛋白质进行初步筛选，然后进行进一步的药物化学运动以增加所散发的化学物质的效力。从屏幕上。经过初步筛选后，出现了一系列正交分析，这些化学分析有助于验证命中的化学物质，并可以对化合物进行分层，以选择最佳化合物以进入命中领先阶段，进而进行前导优化。在这些测定法是基于NMR的水大号igand ö 经由bserved ģ radient 小号pectroscop ý （waterLOGSY ）方法（Dalvit 等人，2000和2001） 。waterLOGSY 是用于检测配体的结合是特别有用的互相作用相对弱与靶蛋白（即，在μM解离常数为低毫范围），如所预期的要与初始命中从一个大的化学或片段库相关联药物化学之前先进行筛分（Lepre，2011），以提高药效和类似药物的性能。
WaterLOGSY 如何工作
该waterLOGSY 方法利用1个小分子的1 H ...
|
|
|
| Isolating Multiple Extracellular Vesicles Subsets, Including Exosomes and Membrane Vesicles, from Bovine Milk Using Sodium Citrate and Differential Ultracentrifugation
|
|
Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] Milk is a complex fluid that contains various types of proteins and extracellular vesicles (EVs). Some proteins can mingle with EVs, and interfere with their isolation. Among these proteins, caseins form micelles of a size comparable to milk EVs, and can thus be co-isolated with EVs. Preliminary steps that affect milk are crucial for EV isolation and impact the purity and abundance of isolated EVs. In the course of our previous works on cow’s milk EVs, we found that sodium citrate (1% final), which is a biocompatible reagent capable of breaking down casein micelles into 40-nm monomers, allowed the isolation of high quantities of EVs with low coprecipitation of caseins or other contaminating proteins. Using this protocol, we successfully separated different EV subsets, characterized in ...
[摘要] [摘要 ] 牛奶是一种复杂的流体，其中包含各种类型的蛋白质和细胞外囊泡（EVs），有些蛋白质会与EV混合在一起，并干扰其分离，在这些蛋白质中，酪蛋白形成的胶束大小与牛奶EV相当因此，可以将其与电动汽车共隔离。影响牛奶的初步步骤对于电动汽车的隔离，影响分离电动汽车的纯度和丰度至关重要。在我们以前对牛奶电动汽车的研究过程中，我们发现柠檬酸钠（最终含量为1％ ）是一种生物相容性试剂，能够将酪蛋白胶束分解为40 nm单体，可分离出大量的EV，而酪蛋白或其他污染蛋白的沉淀率却很低。 EV子集，深入表征其形态，蛋白质含量和小分子RNA富集模式。我们还能够描述其在小鼠肠道炎症模型中的生物学功能。具体来说，是从同一样品中分离出不同乳EV子集的培养基。更具体地说，我们着重介绍了使用柠檬酸钠作为标准化方法来分离和研究乳EV的方法及其在差分超速离心之外的分离技术的潜力。
[背景 ] 在我们以前的出版物（本穆萨等人。，2016 ，2017，2019b和2019c;本穆萨和普罗沃斯特，2019） ，我们强调，牛乳是包含细胞外无数的复杂流体囊泡。（EV）用的子集在这些之中，外泌体是多囊体（MVB）与细胞膜融合时释放的约100 nm囊泡，进行超速离心时，这些沉淀物的离心速度等于或高于100,000 xg （P100K，其中P代表沉淀）（Pieters 等。，2015） ...
|
|
|