| Novel Protein-oligonucleotide Conjugation Method Involving a High-affinity Capture HaloTag
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Highly sensitive quantitative protein profiling can play a key role in the early diagnosis of diseases, such as autoimmune diseases and cancer. We developed a modified protein-oligonucleotide conjugation method termed HaloTag-mediated barcoding, for quantifying protein molecules at a higher sensitivity than conventional protein quantification methods. This novel and efficient conjugation method can be used to prepare HaloTag-barcoded proteins using a click chemistry-based labeling technique. Here, we describe the preparation of protein-DNA complexes and detection of protein-protein interactions which can be used in a HaloTag protein barcode assay to detect an antibody. The protocol includes procedures for preparing the ligand-oligonucleotide complex, plasmid DNA preparation for protein ...
[摘要] [摘要 ] 高灵敏度的定量蛋白质谱分析可以在疾病的早期诊断中发挥关键作用，例如自身免疫性疾病和癌症。我们开发了一种改良的蛋白质-寡核苷酸缀合方法，称为HaloTag 介导的条形码，用于以比常规蛋白质定量方法更高的灵敏度来定量蛋白质分子。可以使用这种基于点击化学的标记技术，将这种新颖而有效的结合方法用于制备HaloTag 条形码蛋白。在这里，我们描述了可在HaloTag中使用的蛋白质-DNA复合物的制备和蛋白质-蛋白质相互作用的检测 蛋白质条形码检测以检测抗体。该方案包括制备配体-寡核苷酸复合物的程序，用于蛋白质表达的质粒DNA制备以及蛋白质-寡核苷酸复合物的制备。所描述的基于点击反应的方案简化了常规胺-酯反应方法，该方法需要色谱纯化的额外步骤。
[背景 ] 蛋白质分子可通过常规实验进行定量酶联免疫吸附测定法，western印迹和质谱的方法，例如。这些常规的定量蛋白质谱分析技术涉及使用校准曲线进行相对测量，而没有考虑DNA扩增的高灵敏度，这限制了蛋白质本身绝对量的检测。化学蛋白质组学成为可能多重测定我n中的相对定量方式，例如串联质量标签标记方法加上质谱（汤普森等人，2003 ）。蛋白质条形码技术与下一代测序技术相结合已经可以识别目标蛋白质分子。这些方法包括CITE- SEQ ，的Ab- SEQ 和L1 BRA- SEQ ...
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| In vitro Assay for Bacterial Membrane Protein Integration into Proteoliposomes
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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] It is important to experimentally determine how membrane proteins are integrated into biomembranes to unveil the roles of the integration factors, and to understand the functions and structures of membrane proteins. We have developed a reconstitution system for membrane protein integration in E. coli using purified factors, in which the integration reaction in vivo is highly reproducible. This system enabled not only analysis of membrane-embedded factors including glycolipid MPIase, but also elucidation of the detailed mechanisms underlying membrane protein integration. Using the system, the integration of membrane proteins can be evaluated in vitro through a protease-protection assay. We report here how to prepare (proteo)liposomes and to determine the ...
[摘要] [摘要 ] 实验确定膜蛋白如何整合到生物膜中以揭示整合因子的作用，并了解膜蛋白的功能和结构非常重要。我们已经开发了一种重组系统，用于使用纯化因子在大肠杆菌中整合膜蛋白，其中体内的整合反应可高度重现。该系统不仅能够分析包括糖脂MPIase在内的膜嵌入因子，而且能够阐明膜蛋白整合背后的详细机制。使用该系统，可以在体外评估膜蛋白的整合 通过蛋白酶保护测定。我们在这里报告了如何准备（PROTEO ）脂质体，并确定膜蛋白结合的活动。
[背景技术 [ 0002 ] 在胞质溶胶中合成的膜蛋白和分泌蛋白分别被整合到生物膜中并跨生物膜转运，以定位在它们的目的地并表达其功能。细胞拥有将膜蛋白整合到生物膜中并使其分泌的蛋白跨生物膜的系统，这些蛋白通常从细菌到高级真核生物都是保守的。
在一种模式生物大肠杆菌中，通过遗传方法鉴定了一些整合因子，这些因子包括SloSecYEG （Newitt和Bernstein，1998），信号识别颗粒（SRP）及其受体SR （Ulbrandt 等，1997）。，和膜蛋白插入酶/分子伴侣YidC （Samuelson et al。，2000）。这些基因研究得到了生化方法的补充。使用体外系统对膜蛋白整合的分子机制进行了广泛的研究，其中蛋白质整合反应在试管中进行。
倒膜囊泡（INV）可通过用French ...
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