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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] In the last decade, genome editing has been the center of attention as a novel tool for mechanistic investigations and for potential clinical applications. Various genome editing tools like meganucleases, zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector-based nucleases (TALEN), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated genes (Cas), have been developed in recent years. For the optimal use as well as continued developments of these genome editing tools, the evaluation of their efficiencies and accuracies is vital. Here, we present a protocol for a reporter based on frameshift fluorescence protein which we recently developed to evaluate the efficiency and accuracy of genome editing tools. In this method, a ~20 bp target sequence ...
[摘要] [摘要] 在过去的十年中，基因组编辑作为一种机制研究和潜在临床应用的新工具已成为关注的焦点。近年来，已开发出各种基因组编辑工具，例如大范围核酸酶，锌指核酸酶（ZFN），转录激活子样基于效应子的核酸酶（TALEN）以及成簇的规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）相关基因（Cas）。 。对于这些基因组编辑工具的最佳使用和持续发展，评估其效率和准确性至关重要。在这里，我们介绍了一种基于移码荧光蛋白的报告子方案，我们最近开发了该方案以评估效率和 基因组编辑工具的实用性。在这种方法中，在天蓝色荧光蛋白（CFP）的起始密码子后插入一个约20 bp的包含移码的靶序列，以使其荧光失活，并且只有新的插入/缺失事件会重新激活CFP 荧光。 。为了增加可追溯性，将内部核糖体进入位点和红色荧光蛋白mCherryFP 放置在报告子的下游。由in / del介导的荧光恢复产生的CFP阳性细胞的百分比可以通过荧光测量装置定量，作为基因组编辑频率的读数。作为演示，我们在这里介绍CRISPR-Cas9技术的使用以及流式细胞仪作为荧光变化的读数。
[背景] 基因组编辑工具对于生物学机制的研究以及遗传疾病的预防和/或治疗非常重要（Maeder和Gersbach，2016）。在最近的几十年中，引入了几种基因组编辑工具，包括大范围核酸酶（Epinat 等，2003），锌指核酸酶（ZFN）（Kim ...
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