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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive hematological malignancy that arises from transformation of T-cell primed hematopoietic progenitors. Although T-ALL is a heterogenous and molecularly complex disease, more than 65% of T-ALL patients carry activating mutations in the NOTCH1 gene. The majority of T-ALL–associated NOTCH1 mutations either disrupt the negative regulatory region, allowing signal activation in the absence of ligand binding, or result in truncation of the C-terminal PEST domain involved in the termination of NOTCH1 signaling by proteasomal degradation. To date, retroviral transduction models have relied heavily on the overexpression of aggressively truncated variants of NOTCH1 (such as ICN1 or ΔE-NOTCH1), which result in ...
[摘要] [摘要 ] T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种侵袭性血液恶性肿瘤，其起源于T细胞引发的造血祖细胞的转化。尽管T-ALL是一种异质且分子复杂的疾病，但超过65％的T-ALL患者在NOTCH1 基因中带有激活突变。大多数与T-ALL相关的NOTCH1 突变要么破坏负调控区，允许在没有配体结合的情况下激活信号，要么导致蛋白酶体降解终止NOTCH1信号终止所涉及的C末端PEST域被截短。迄今为止，逆转录病毒转导模型在很大程度上依赖于侵袭性截短的变种的过度表达。 NOTCH1 （例如ICN1或ΔE-NOTCH1）可导致信号传导的超生理水平，并且在人类T-ALL中很少见。当前方案描述了小鼠骨髓分离，造血干细胞和祖细胞（HSC）富集，然后逆转录病毒转导的致癌突变体形式的NOTCH1受体（NOTCH1-L1601P-ΔP）的方法，该方法与获功能突变最常见于患者样品中。组成型活性NOTCH1的这种强制表达的标志是胸腺外未成熟T细胞发育的瞬时波，此波在致癌性转化为T-ALL之前。此外，该方法通过允许白血病细胞与微环境之间的串扰来模拟体内白血病的转化和进展，这是基于细胞系的体外研究无法解释的一个方面。因此，HSC转导和移植模型更真实地概括了人类疾病的发展，为进一步的体内和离体功能研究提供了高度全面和通用的工具。
[背景 ] ...
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Date:
2020-05-20
[Abstract] In the last decade, genome editing has been the center of attention as a novel tool for mechanistic investigations and for potential clinical applications. Various genome editing tools like meganucleases, zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector-based nucleases (TALEN), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated genes (Cas), have been developed in recent years. For the optimal use as well as continued developments of these genome editing tools, the evaluation of their efficiencies and accuracies is vital. Here, we present a protocol for a reporter based on frameshift fluorescence protein which we recently developed to evaluate the efficiency and accuracy of genome editing tools. In this method, a ~20 bp target sequence ...
[摘要] [摘要] 在过去的十年中，基因组编辑作为一种机制研究和潜在临床应用的新工具已成为关注的焦点。近年来，已开发出各种基因组编辑工具，例如大范围核酸酶，锌指核酸酶（ZFN），转录激活子样基于效应子的核酸酶（TALEN）以及成簇的规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）相关基因（Cas）。 。对于这些基因组编辑工具的最佳使用和持续发展，评估其效率和准确性至关重要。在这里，我们介绍了一种基于移码荧光蛋白的报告子方案，我们最近开发了该方案以评估效率和 基因组编辑工具的实用性。在这种方法中，在天蓝色荧光蛋白（CFP）的起始密码子后插入一个约20 bp的包含移码的靶序列，以使其荧光失活，并且只有新的插入/缺失事件会重新激活CFP 荧光。 。为了增加可追溯性，将内部核糖体进入位点和红色荧光蛋白mCherryFP 放置在报告子的下游。由in / del介导的荧光恢复产生的CFP阳性细胞的百分比可以通过荧光测量装置定量，作为基因组编辑频率的读数。作为演示，我们在这里介绍CRISPR-Cas9技术的使用以及流式细胞仪作为荧光变化的读数。
[背景] 基因组编辑工具对于生物学机制的研究以及遗传疾病的预防和/或治疗非常重要（Maeder和Gersbach，2016）。在最近的几十年中，引入了几种基因组编辑工具，包括大范围核酸酶（Epinat 等，2003），锌指核酸酶（ZFN）（Kim ...
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