| Site-specific DNA Mapping of Protein Binding Orientation Using Azidophenacyl Bromide (APB)
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] The orientation of a DNA-binding protein bound on DNA is determinative in directing the assembly of other associated proteins in the complex for enzymatic action. As an example, in a replisome, the orientation of the DNA helicase at the replication fork directs the assembly of the other associated replisome proteins. We have recently determined the orientation of Saccharalobus solfataricus (Sso) Minichromosome maintenance (MCM) helicase at a DNA fork utilizing a site-specific DNA cleavage and mapping assay. Here, we describe a detailed protocol for site-specific DNA footprinting using 4-azidophenacyl bromide (APB). This method provides a straightforward, biochemical method to reveal the DNA binding orientation of SsoMCM helicase and can be applied to other DNA binding ...
[摘要] [摘要 ] 结合在DNA上的DNA结合蛋白的方向决定了复合物中其他相关蛋白的组装，以进行有意的作用。例如，在复制体中，复制叉处的DNA解旋酶的方向指导我们最近通过定点DNA切割和作图分析确定了DNA叉处的Saccharalobus solfataricus （Sso ）微型染色体维持（MCM）解旋酶的方向。 使用4-叠氮苯甲酰溴（APB）进行位点特异性DNA足迹的详细协议。此方法提供了一种直接的生化方法来揭示Sso MCM解旋酶的DNA结合方向，并可应用于其他DNA结合蛋白。
[背景 ] DNA复制是其中基因组双链体链分离成两个模板链中，超前和滞后strands.This功能是通过在生命。如同其他环状六聚体的解旋酶结构域的所有的环状六聚体解旋酶的处理，从理论上讲，这些结构域中的任何一个都可以在易位期间朝向复制叉，并且与已知的3'-5 MCM包含两个结构域； N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）。' 易位directionality.T 他MCM解旋酶负载到DNA起源作为具有面向易位期间解旋酶的每个other.The取向管畸形双六聚体确定两个六聚体是否彼此或旁路彼此活性unwinding.Our最近的一篇论文中离解远表明Saccharolobus solfataricus （Sso MCM ）通过NTD引导DNA解链（Perera和Trakselis ...
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| Generation, Analyzing and in-vivo Drug Treatment of Drosophila Models with IBMPFD
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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] Missense mutations of p97/cdc48/Valosin-containing protein (VCP) cause inclusion body myopathy, Paget disease with frontotemporal dementia (IBMPFD) and other neurodegenerative diseases. The pathological mechanism of IBMPFD is not clear and there is no treatment. We generated Drosophila models of IBMPFD in adult flight muscle in vivo. Here we describe a variety of assays to characterize disease pathology and dissect disease mechanism, and the consequences of in vivo feeding of VCP inhibitors.
[摘要] [ 摘要] p97 / cdc48 / Valosin 含蛋白（VCP）的错义突变导致包涵体肌病，额颞叶痴呆的Paget病（IBMPFD）和其他神经退行性疾病。IBMPFD的病理机制尚不清楚，也没有治疗方法。我们生成了在成人体内飞行肌肉中IBMPFD的果蝇模型。在这里，我们描述了各种测定方法，以表征疾病病理和解剖疾病机制，以及体内VCP抑制剂的喂养后果。
[ 背景] VCP / p97 突变导致包涵体肌病，骨骼的Paget病和额颞叶性痴呆（IBMPFD），这是以常染色体显性方式在包括脑，肌肉和骨骼在内的多个系统中退化的疾病（Watts 等人，2004年） ）。VCP的突变还与1-2％的散发性肌萎缩性侧索硬化症（ALS）以及遗传性痉挛性截瘫和Charcot-Marie-Tooth 2神经病有关（Abramzon 等，2012； de Bot 等，2012； Gonzalez 等，2014）。R155H突变是患者中最常见的突变，而具有A232E突变的个体具有最严重的临床表现（Kimonis 等，2008a； Ritson 等，2010）。90％的IBMPFD患者出现肌病，这是最早的症状（Weihl 等，2009）。50％的患者会发展成佩吉特氏骨病，影响头骨，脊柱，臀部和长骨。三分之一的患者发生额颞叶痴呆（Kimonis 等，2008b； Weihl ...
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