| Candida albicans Culture, Cell Harvesting, and Total RNA Extraction
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Transcriptional analysis has become a cornerstone of biological research, and with the advent of cheaper and more efficient sequencing technology over the last decade, there exists a need for high-yield and efficient RNA extraction techniques. Fungi such as the human pathogen Candida albicans present a unique obstacle to RNA purification in the form of the tough cell wall made up of many different components such as chitin that are resistant to many common mammalian or bacterial cell lysis methods. Typical in vitro C. albicans cell harvesting methods can be time consuming and expensive if many samples are being processed with multiple opportunities for product loss or sample variation. Harvesting cells via vacuum filtration rather than centrifugation cuts down on time before the cells are ...
[摘要] [摘要]转录分析已成为生物学研究的基石,并且在最近十年中,随着廉价,高效测序技术的出现,对高产量,高效率的RNA提取技术存在着需求。真菌如人病原体白色念珠菌呈现出独特的障碍RNA纯化在坚韧细胞壁的形式作出许多不同的部件,例如几丁质的最多的是对许多常见的哺乳动物细胞或细菌细胞裂解的方法具有抗性。典型的体外白色念珠菌 如果要处理的样品很多,并且产品损失或样品变化的机会很多,则细胞采集方法可能既耗时又昂贵。通过真空过滤而不是离心收集细胞可以减少冷冻前的时间,因此可以改变RNA表达谱的可用时间。对于白色念珠菌而言,真空过滤是优选的,这主要有两个原因:由于暴露的表面积增加,非丸状细胞的细胞裂解速度更快,并且与酵母或细菌细胞不同,丝状细胞首先难以沉淀。与酶法处理相比,使用机械细胞裂解法(通过氧化锆/二氧化硅珠子)可减少加工时间以及总成本。总的来说,该方法是从白念珠菌的体外培养物中提取总RNA的快速,高效且高产率的方法。
[背景]需要快速,可重复的,高效的RNA提取技术已经显著在过去几年里,由于使用RNA测序等表达分析技术的稳步增长成长是变得更加经济实惠,并与测序技术的改进速度更快。各种公司和实验室提供了许多不同的工具包和协议,试图满足这一需求。但是,专门为一种真菌建立的方法可能不适用于另一种真菌,而试剂盒平台由于其应用范围太广,常常会不足。在这里,我们描述了一种细胞培养物,收获,和RNA提取方法为致病性真菌,白色念珠菌,其利用的技术的组合,得到以一致和有效的方式既高产率和高质量的RNA。 ...
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| Purification of Protein-complexes from the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 Using FLAG-affinity Chromatography
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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] Exploring the structure and function of protein complexes requires their isolation in the native state–a task that is made challenging when studying labile and/or low abundant complexes. The difficulties in preparing membrane-protein complexes are especially notorious. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 is a widely used model organism for the physiology of oxygenic phototrophs, and the biogenesis of membrane-bound photosynthetic complexes has traditionally been studied using this cyanobacterium. In a typical approach, the protein complexes are purified with a combination of His-affinity chromatography and a size-based fractionation method such as gradient ultracentrifugation and/or native electrophoresis. However, His-affinity purification harbors prominent ...
[摘要] [摘要] 探索蛋白质复合物的结构和功能需要在天然状态下对其进行分离- 当研究不稳定和/或低丰度复合物时,这项任务变得具有挑战性。制备膜-蛋白质复合物的困难尤其出名。蓝藻集胞藻 PCC 6803是一种用于氧合营养养分生理的广泛使用的模式生物,传统上已经使用这种蓝细菌研究了膜结合的光合复合物的生物发生。在典型方法中,蛋白质复合物是通过His-affinity色谱法和基于大小的分级分离方法结合纯化的 例如梯度超速离心和/或天然电泳。但是,His亲和纯化带有明显的污染物,许多蛋白质的含量太低,无法进行可行的多步纯化。在这里,我们已经开发出一种纯化方法,用于从膜突囊藻的膜和可溶性级分中分离出3x FLAG标签的蛋白。可溶性蛋白或可溶类囊体经过单一亲和纯化步骤,该步骤利用FLAG亲和树脂的高度特异性结合。彻底洗涤后,使用过量的合成3x FLAG肽在自然条件下将捕获的蛋白质从树脂中释放出来。该方案可以快速分离出纯度极高的低丰度蛋白质复合物。
[背景 ] 蓝藻已被用作优选的模型系统以研究光合蛋白复合物的生物合成和功能的几十年。蓝细菌中的光合作用装置与真核系统(藻类和植物)非常相似,但是蓝细菌具有原核模型的所有优点,例如快速生长和小的基因组,可以轻松地进行基因操作以及使用细菌遗传学的标准工具。特别是,集胞藻。PCC ...
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