| Cleavable Affinity Purification (Cl-AP): A One-step Procedure to Affinity Purify Protein Complexes
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] Cleavable Affinity Purification (Cl-AP) uses a tripartite system of Protein-A-Streptavidin beads and nanobodies, coupled with a biotinylated, thiol-cleavable linker, providing one-step affinity purification from lysates of tissues expressing tagged proteins. This technique allows fluorescent versions of mitotic protein complexes to be isolated intact from cells, for use in biophysical and microscopy-based assays, overcoming the traditional limitations of reductionist approaches. We have used this technique successfully to purify both GFP-tagged and mCherry-tagged proteins, and their interacting partners, expressed in Drosophila melanogaster embryos. Although we demonstrate the efficacy of the GFP-binding protein and RFP-binding protein nanobodies from Chromotek, in theory any antibody ...
[摘要] [摘要]裂解亲和纯化（Cl-AP）使用蛋白质A-链霉亲和素珠和纳米抗体的三方体系，再加上生物素化的，硫醇可裂解的接头，可从表达标记蛋白的组织裂解物中一步纯化。这项技术可以从细胞中完整分离出荧光形式的有丝分裂蛋白复合物，用于生物物理和基于显微镜的分析中，克服了还原论方法的传统局限性。我们已经成功地使用了该技术来纯化在果蝇中表达的GFP标记和mCherry标记的蛋白及其相互作用的伴侣。 胚胎。尽管我们证明了Chromotek的GFP结合蛋白和RFP结合蛋白纳米抗体的功效，但从理论上讲，任何抗体都可以偶联至磁珠并用作Cl-AP试剂。
[背景技术]许多蛋白质引起它们的细胞功能的多蛋白复合物的一部分。为了全面了解蛋白质复合物的作用，需要将体内方法（例如干扰蛋白质水平/活性或监测动态定位）与体外生化测定和功能重建结合起来。目前，这种整体方法受到严重限制。体外研究通常使用已在非自体系统（例如细菌和昆虫细胞）中单独表达和纯化的蛋白质，其中对于功能至关重要的折叠和翻译后修饰可能与原始细胞中发现的不同。相反，从细胞/组织中纯化特定蛋白质或复合物通常依赖于共免疫沉淀或纯化已引入细胞的目标蛋白质的标记版本，例如使用血凝素（HA），FLAG 3或串联亲和纯化（TAP）标记。这些体内方法存在两个主要问题：（i ...
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| Isolation of Lipid Rafts from Cultured Mammalian Cells and Their Lipidomics Analysis
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Lipid rafts are distinct liquid-ordered domains of plasma membranes of most eukaryotic cells providing platform for signaling pathways. Lipid composition of rafts is critical for their structural integrity and for regulation of signaling pathways originating from rafts. Here we provide a protocol to isolate lipid rafts from cultured human and animal cells and comprehensively analyse their lipid composition.
[摘要] [摘要]脂质筏是大多数真核细胞浆膜中独特的液态有序域，为信号传导途径提供平台。脂质筏的脂质组成对其结构的完整性和对源自脂质筏的信号传导途径的调节至关重要。在这里，我们提供了一个协议，从培养的人和动物细胞分离脂质筏，并全面分析其脂质组成。
关键词脂质筏，脂质，脂质组学，胆固醇，膜
[背景]脂质筏是细胞膜中独特的富含胆固醇和鞘氨醇的结构，浸入液态无序的周围膜中(Lingwood和Simons，2010年)。它们提供了一个"坚实"的平台，在空间上组织各种信号传导途径的元素，以及外泌和内吞机制。脂筏的功能特性由脂筏脂质和蛋白质之间的相互作用决定。脂筏脂质组成的变化，无论是生理性的还是病理性的，都会对源自脂筏的途径的活性产生惊人的后果，并代表了其调节的一个重要的、未被充分重视的层面。脂质筏的分离因其动态性和异质性而变得复杂。基于它们对洗涤剂的抵抗力的筏子分离的方法一直受到批评（高斯 et al., 2005)。在这里，我们描述了一个无洗涤剂的方法，用于分离脂筏和建立他们的脂质组成，使用综合脂质组学分析。最近发表了一个使用该协议的例子（Mukhamedova等人，2019）。
第一部分：脂质筏的分离
下面描述的协议是用来从RAW ...
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| Rapid Generation of Human Neuronal Cell Models Enabling Inducible Expression of Proteins-of-interest for Functional Studies
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 technology has transformed the ability to edit genomic sequences and control gene expression with unprecedented ease and scale. However, precise genomic insertions of coding sequences using this technology remain time-consuming and inefficient because they require introducing adjacent single-strand cuts through Cas9 nickase action and invoking the host-encoded homology-directed repair program through the concomitant introduction of large repair templates. Here, we present a system for the rapid study of any protein-of-interest in two neuronal cell models following its inducible expression from the human AAVS1 safe harbor locus. With lox-flanked foundation cassettes in the AAVS1 site and a tailor-made plasmid for accepting coding sequences-of-interest in ...
[摘要] [摘要] CRISPR-Cas9技术以前所未有的简便性和规模改变了编辑基因组序列和控制基因表达的能力。但是，由于需要引入相邻的单链，因此使用该技术进行精确的基因组编码插入仍然很耗时且效率低下。通过减少Cas9切口酶的作用并通过同时引入大型修复模板来调用宿主编码的同源性指导的修复程序。在此，我们提出了一种系统，用于在其诱导后的两个神经元细胞模型中快速研究任何目的蛋白该系统可从人类AAVS1 安全港基因座表达，在AAVS1 位点具有lox侧翼的基础盒和定制的质粒以接受感兴趣的编码序列，该系统使研究人员能够为诱导型产生自己的神经元细胞模型任何编码表达序列不到一个月的时间。由于可用性Preinserted 增强型绿色的Fluo 可以与目标蛋白质融合的最新蛋白质（EGFP）编码序列，该系统可帮助功能研究通过活细胞显微镜以及利用非常有效的可用性进行的相互作用组分析来跟踪目标蛋白质EGFP捕获矩阵。
[背景] ...
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