| Transfection and Activation of CofActor, a Light and Stress Gated Optogenetic Tool, in Primary Hippocampal Neuron Cultures
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Author:
Date:
2021-04-20
[Abstract] Proteins involved in neurodegeneration can be coupled with optogenetic reagents to create rapid and sensitive reporters to provide insight into the biochemical processes that mediate the progression of neurodegenerative disorders, including Alzheimer’s Disease (AD). We have recently developed a novel optically-responsive tool (the ‘CofActor’ system) that couples cofilin and actin (key players in early stage cytoskeletal abnormalities associated with neurodegenerative disorders) with light-gated optogenetic proteins to provide spatial and temporal resolution of oxidative and energetic stress-dependent biochemical events. In contrast to currently available small-molecule based biosensors for monitoring changes in the redox environment of the cell, CofActor is a ...
[摘要] [摘要]参与神经变性蛋白质可具有耦合光遗传学试剂来创建快速且灵敏的记者到provid Ë洞察介导的神经变性疾病，包括进展的生化过程阿尔茨海默氏病（AD）。我们最近开发了一种新型光学-响应工具（“辅”系统）夫妇COF伊林和行动中使用（与神经退行性疾病相关的早期阶段，细胞骨架异常关键球员）光门控光遗传学 蛋白质提供时空分辨率的氧化和高能应激依赖的生化事件。与目前可用的基于小分子的生物传感器来监测细胞氧化还原环境的变化相比，CofActor是一种光激活的，遗传编码的氧化还原传感器，可以通过精确的空间和时间控制来激活。在这里，我们描述了从新生小鼠制备的解离海马神经元培养物中CofActor系统的表达和激活的协议。将培养物转染用大号ipofectamine上的第五天体外（DIV5），然后暴露于细胞应激诱导刺激，导致的肌动蛋白的形成丝切蛋白可使用活细胞成像技术可以观察到杆。本文所述的方案可用于研究暴露于神经退行性刺激（例如毒性Aβ42低聚物）的活神经元中与压力相关的细胞骨架失调。此外，从AD的转基因小鼠模型和/或与KO相关的小鼠KO小鼠分离的神经元中传感器的表达可以促进我们对与神经变性相关的早期细胞骨架功能障碍的分子基础的理解。
[背景]神经变性疾病的生化标志（神经原纤维，团块和缠结，提高活性氧物质（ROS） ...
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| HIV-CRISPR: A CRISPR/Cas9 Screening Method to Identify Genes Affecting HIV Replication
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Screening with CRISPR/Cas9 technology has already led to significant discoveries in the fields of cancer biology, cell biology and virology. Because of the relatively low false discovery rates and the ability to perform high-throughput, pooled approaches, it has rapidly become the assay of choice for screening studies, including whole-genome screens. Here, we describe a CRISPR screening protocol that allows for efficient screening of the entire life cycle of HIV-1 through packaging of the HIV-CRISPR lentiviral genomes by infecting HIV-1 virus in trans.
[摘要] [摘要 ] CRISPR / Cas9技术的筛选已经在癌症生物学，细胞生物学和病毒学领域引起了重大发现。由于相对较低的错误发现率和执行高通量，合并方法的能力，它发展迅速。成为筛选研究（包括全基因组筛选）的首选检测方法。在此，我们描述了一种CRISPR筛选方案，该方案可通过感染HIV-CRISPR慢病毒基因组来包装，从而有效筛选HIV-1的整个生命周期。病毒1 在 跨。
[背景] 遗传筛选是鉴定影响包括人类免疫缺陷病毒（HIV）在内的病毒复制的新基因的有力工具。鉴定对HIV感染重要的宿主基因有助于增强对HIV复制，进化，传播和发病机制的认识，这是关键利益所在。特别是在过去十年中，通常是干扰素（IFN）刺激基因（ISG）的HIV限制因子的发现已成为逆转录病毒学领域的关键发展。限制因子已集中在过度表达筛选上，以鉴定作用广泛的抗病毒ISG （Schoggins 等，2011）或专门针对HIV的因子（Kane 等，2016）。通过转染对HIV限制因子进行了全基因组筛选siRNA的池池在靶细胞（刘等人，2011年）。然而，这些方法缺乏稳健性，Versa的钛Lity，和高通量方面 因此，我们使用CRISPR / Cas9技术开发了一种创新的ap 方法，并依靠HIV交叉包装通过CRISPR / Cas9文库转导的细胞中表达的慢病毒基因组的能力（OhAinle ...
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