| Molecular and Phenotypic Characterization Following RNAi Mediated Knockdown in Drosophila
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Author:
Date:
2021-02-20
[Abstract] Loss of function studies shed significant light on the involvement of a gene or gene product in different cellular processes. Short hairpin RNA (shRNA) mediated RNA interference (RNAi) is a classical yet straightforward technique frequently used to knock down a gene for assessing its function. Similar perturbations in gene expression can be achieved by siRNA, microRNA, or CRISPR-Cas9 methods also. In Drosophila genetics, the UAS-GAL4 system is utilized to express RNAi and make ubiquitous and tissue-specific knockdowns possible. The UAS-GAL4 system borrows genetic components of S. cerevisiae, hence rule out the possibility of accidental expression of the system. In particular, this technique uses a target-specific shRNA, and the expression of the same is governed by the upstream activating ...
[摘要] [摘要]功能丧失的研究为基因或基因产物在不同细胞过程中的参与提供了重要启示。短发夹RNA（shRNA）介导的RNA干扰（RNAi）是一种经典而直接的技术，经常用于敲低基因以评估其功能。也可以通过siRNA，microRNA或CRISPR-Cas9方法实现类似的基因表达扰动。在果蝇遗传学中，UAS-GAL4系统用于表达RNAi，并使遍在和组织特异性的基因敲除成为可能。UAS-GAL4系统借鉴了酿酒酵母的遗传成分，因此排除了系统意外表达的可能性。特别地，该技术使用靶标特异性shRNA，并且其表达受上游激活序列（UAS）支配。由特定启动子调节的GAL4受控表达可以普遍或以组织特异性方式驱动干扰RNA的表达。通过RNA分离和半定量RT-PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳来测量敲低效率。我们还采用了免疫染色程序来评估击倒效率。
RNAi为研究人员提供了降低基因产物水平（相当于亚同型条件）并研究结果的选择。基于UAS-GAL4的RNAi方法提供了基因表达的时空调节，还有助于推断早期发育阶段所需的基因功能。
[背景]果蝇果蝇（果蝇）是在研究实验室经常使用的一种通用模式生物。果蝇易于处理，繁殖和维护。而且，精心制作却寿命短，繁殖力高的果蝇具有更多的优势。果蝇遗传学工具的易用性有助于发展对基因功能的全面了解。由于果蝇基因中有60％与人类基因同源，并且具有前面提到的其他优点，因此果蝇是研究体内基因功能的显而易见的模型生物。 ...
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| Assessing in vitro and in vivo Trogocytosis By Murine CD4+ T cells
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Recognition of antigens by lymphocytes (B, T, and NK) on the surface of an antigen-presenting cell (APC) leads to lymphocyte activation and the formation of an immunological synapse between the lymphocyte and the APC. At the immunological synapse APC membrane and associated membrane proteins can be transferred to the lymphocyte in a process called trogocytosis. The detection of trogocytosed molecules provides insights to the activation state, antigen specificity, and effector functions and differentiation of the lymphocytes. Here we outline our protocol for identifying trogocytosis-positive CD4+ T cells in vitro and in vivo. In vitro, antigen presenting cells are surface biotinylated and pre-loaded with magnetic polystyrene beads before incubating for ...
[摘要] [摘要 ] 抗原呈递细胞（APC）表面的淋巴细胞（B，T和NK）识别抗原会导致淋巴细胞活化并在淋巴细胞和APC之间形成免疫突触。在免疫突触处APC膜和相关的膜蛋白可以转移调用Trogocytosis到淋巴细胞的过程。检测Trogocytosed分子提供见解的激活状态，抗原特异性和效应器功能和差异的淋巴细胞。这里我们列出了我们的协议，用于识别Trogocytosis CD4阳性Tasu 性T细胞在体外和体内。体外，抗原呈递细胞是表面 生物素化并预装磁性聚苯乙烯珠，然后与体外活化的CD4 + T细胞胚细胞（90分钟）或幼稚T细胞（3-24小时）短时间孵育。阳性（trog + ）细胞可通过链霉亲和素染色来筛选经生物素化的经转钙蛋白的APC膜蛋白，然后立即或在随后的孵育后通过流式细胞仪分析其激活表型，效应子功能和效应子的分化，例如，可以鉴定出嗜光细胞的阳性细胞。以前的研究已经描述了分析T细胞嗜光性的方法，以鉴定抗原特异性细胞或被细胞识别的抗原表位。使用当前方案，嗜光性对单个T细胞的影响或能力trog + T细胞调节其他免疫细胞的激活和功能的能力可在一个扩展范围内进行评估 ed时间段。
[背景 ] Trogocytosis是质膜和膜相关分子的细胞间转移。这种现象已在免疫细胞相互作用的分析中得到了广泛研究，并已观察到包括向CD4 +的转移（Wetzel 等，2005； ...
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