| Primer ID Next-Generation Sequencing for the Analysis of a Broad Spectrum Antiviral Induced Transition Mutations and Errors Rates in a Coronavirus Genome
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] Next generations sequencing (NGS) has become an important tool in biomedical research. The Primer ID approach combined with the MiSeq platform overcomes the limitation of PCR errors and reveals the true sampling depth of population sequencing, making it an ideal tool to study mutagenic effects of potential broad-spectrum antivirals on RNA viruses. In this report we describe a protocol using Primer ID sequencing to study the mutations induced by antivirals in a coronavirus genome from an in vitro cell culture model and an in vivo mouse model. Viral RNA or total lung tissue RNA is tagged with Primer ID-containing cDNA primers during the initial reverse transcription step, followed by two rounds of PCR to amplify viral sequences and incorporate sequencing adaptors. Purified and pooled ...
[摘要] [摘要]下一代测序（NGS）已成为生物医学研究的重要工具。结合MiSeq平台的Primer ID方法克服了PCR错误的局限性，并揭示了群体测序的真实采样深度，使其成为研究潜在的广谱抗病毒剂对RNA病毒的诱变作用的理想工具。在本报告中，我们描述了一种使用引物ID测序的方案，用于研究体外细胞培养模型和体内小鼠模型中冠状病毒基因组中抗病毒药诱导的突变。在最初的反转录步骤中，病毒RNA或总肺组织RNA用含Primer ID的cDNA引物标记，然后进行两轮PCR扩增病毒序列并整合测序适配器。使用MiSeq平台对纯化和合并的文库进行测序。测序数据使用模板共有序列（TCS）网络应用处理。引物ID方法提供了一种精确的测序方案，可以测量病毒RNA基因组和宿主mRNA中的突变错误率。测序结果表明，β-D-N4-羟基胞嘧啶核苷（NHC）大大提高了病毒RNA基因组中的过渡取代率，但并未显着提高颠覆取代率，并且发现胞嘧啶（C）至尿苷（U）是最常见的突变。
[背景]下一代测序（NGS）已被广泛应用在生物医学研究中使用在过去十年。当应用NGS研究宿主内病毒种群的RNA病毒时，需要考虑对文库制备和测序方案的修改。样本之间的病毒滴度（或病毒载量）差异很大。传统的NGS平台在测序运行中需要1-500 ng的DNA（或RNA），但在大多数情况下，临床样品中的病毒RNA少于100 ...
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| Isolation and Quantification of Extracellular DNA from Biofluids
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Extracellular DNA is studied as a diagnostic biomarker, but also as a factor involved in the pathophysiology of several diseases due to its pro-inflammatory properties. Extracellular DNA can be extracted from plasma, urine, saliva or other biofluids using standard DNA isolation procedures and specialized commercial kits. Sample preparation for isolation is important, freezing and thawing may affect the amount of extracellular DNA extracted. Subsequent centrifugations remove cells and cell debris from the samples to obtain true extracellular DNA. Small volume of samples especially from animal experiments is often an issue and it affects the DNA yield. Very short fragments (˂ 100 bp) can be lost during isolation and are difficult to quantify using PCR. Fluorometric methods asses all stained ...
[摘要] [摘要 ] 研究细胞外DNA作为一种诊断性生物标志物，但由于其具有促炎性，也可以作为多种疾病的病理生理因素。可以使用标准DNA分离程序和专门的商业试剂盒从血浆，尿液，唾液或其他生物流体中提取细胞外DNA。样品制备对于分离非常重要，冷冻和解冻可能会影响提取的细胞外DNA的量。随后的离心去除样品中的细胞和细胞碎片，以获得真正的细胞外DNA。少量样品尤其是动物实验样品常常是一个问题，它会影响DNA产量。片段很短（˂ 100 bp）在分离过程中可能会丢失，并且难以使用PCR进行定量。荧光法评估所有染色的DNA片段。选择定量细胞外DNA的方法至关重要，并且至少两种方法的组合是理想的。程序的标准化或至少在研究论文中的报告对于比较结果至关重要。
[背景 ] 胞外DNA通常被称为无细胞DNA是所有DNA的一个术语发现特别是在诊断生物流体细胞外。血浆DNA最早是由Mandel和Metais （1948）发现的。后来人们对所谓的液体活检的研究激发了人们对细胞外DNA研究的兴趣，液体活检作为无创筛选和诊断的基于DNA的生物标志物的来源（Poon和Lo，2001）。相同的胞外DNA，然而，也参与炎性疾病，如败血症的病理生理学（Lauková 等人，2017） ，急性肾损伤（詹森等人，2017）和急性肝衰竭（Vokálová ...
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| Circadian Gene Profiling in Laser Capture Microdissected Mouse Club Cells
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Cell heterogeneity is high in tissues like lung. Research conducted on pure population of cells usually offers more insights than bulk tissues, such as circadian clock work. In this protocol, we provide a detailed work flow on how to do circadian clock study by RNA seq in laser capture micro-dissected mouse lung club cells. The method uses frozen tissues and is highly reproduciable.
[摘要] [摘要] 在肺等组织中细胞异质性很高。对纯细胞群体的研究通常比诸如昼夜节律的大块组织提供更多的见解。在本协议中，我们提供了有关如何进行昼夜节律研究的详细工作流程。用RNA seq技术在激光捕获的小鼠肺部微小组织中进行捕获。该方法使用冷冻的组织，具有很高的重现性。
[背景 ] 昼夜节律钟遍布全身，并且在肺中显示出在Club细胞中强烈振荡（Gibbs 等人，2009年和2014年），之前在小鼠和大鼠中进行了整个肺节律基因分析（Sukumaran 等人）。。，2011 ; 张等人。2014）。然而，至少15 Pasento那些昼夜基因是即将从白细胞（Haspel的等人。2014）。它是有用的，但很难得到小区类型特定的节律基因分析，鉴于组织中细胞群体的异质性很高。通常通过组织消化和流式细胞仪分选来解决这个问题，但尚不清楚在此过程中基因表达是否会发生变化。另一种方法是使用激光捕获显微解剖从靶标中提取靶细胞固定的组织，请注意这可能会导致特定的细胞群纯度。特定的细胞群可以通过抗体染色或解剖学信息来识别。就肺中的Club细胞而言，已知它们富含 十年前发表了一项协议，展示了如何使用激光捕获（PixCell II激光捕获显微切割系统）的Club细胞RNA进行微阵列操作的协议，该技术已有一些进展（Betsuyaku and Senior，2004 ; Cummings ...
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