| Single Cell Migration Assay Using Human Breast Cancer MDA-MB-231 Cell Line
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Cell migration is a fundamental cellular process that plays a crucial role in many physioglogical and pathological processes such as wound healing or cancer metastasis. Many assays have been developed to examine cell migration, such as the wound healing or scratch assay, Boyden Chamber or transwell assay, and the method we will describe here, single cell migration assay. In this assay, cells are plated sparsely on a collagen coated plate and live cell imaging is performed over a period of 2 h at 1 frame per minute. After imaging is completed, cells are tracked manually using ImageJ by tracking movement of the centroid of the cell. These data points are then exported and overall distance travelled from frame to frame is determined and divided by total time imaged to determine speed of the ...
[摘要] [摘要 ] 细胞迁移是一个基本的细胞过程，在许多生理和病理过程中（如伤口愈合或癌症转移）起着至关重要的作用，已经开发了许多检测细胞迁移的方法，例如伤口愈合或刮擦实验，Boyden Chamber或Transwell 分析，我们将在此介绍的方法是单细胞迁移分析。在此分析中，将细胞稀疏地铺在胶原蛋白包被的板上，并在2小时内进行活细胞成像 成像完成后，通过跟踪细胞质心的运动使用ImageJ手动跟踪细胞，然后导出这些数据点，确定帧与帧之间的总距离并除以成像的总时间确定细胞的速度。此方法提供了一种在进行更复杂的测定之前检查细胞操作对细胞迁移影响的快速方法。
[背景 ] 细胞迁移在从胚胎发育到血管生成和肿瘤转移的生理和病理过程中均起着重要作用（Le Clainche 和Carlier ，2008）。细胞运动是高度精心策划的事件，可以概括为四个基本步骤的循环：我）膜伸出驱动下肌动蛋白聚合，二）稳定突出通过整合素介导的细胞-基质粘附，III）细胞体易位驱动通过肌动球蛋白收缩力，最后，IV）后发布结果的Mechan 的iCal力和/或细胞基质粘附组分的蛋白水解作用（Sheetz 等，1999 ; Ridley 等，2003; Panetti 等，2004; Stradal and Scita ，2006; Tomasevic 等，2007; Le Clainche and ...
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| An in vitro Assay to Screen for Substrates of PKA Using Phospho-motif-specific Antibodies
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Kinases function as regulators of many cellular processes such as cell migration. These enzymes typically phosphorylate target motif sequences. Mass spec or phospho-specific antibody detection can be used to determine whether a kinase can phosphorylate proteins of interest, however, mass spec can be expensive and phospho-antibodies for the protein of interest may not exist. In this protocol, we will describe an in vitro kinase assay to provide a preliminary readout on whether a protein of interest may be phosphorylated by PKA. Our protein of interest is purified after expression in bacteria and treated with recombinant PKA from bovine heart. Protein is then extracted and a western blot is performed using a phospho-specific antibody for PKA’s target motif. This will allow us to ...
[摘要] [摘要 ] 激酶可充当许多细胞过程（例如细胞迁移）的调节剂，这些酶通常可磷酸化靶基序序列，质谱或磷酸特异性抗体检测可用于确定激酶是否可磷酸化目标蛋白。能成为规格昂贵和磷酸化抗体蛋白的兴趣可能就不存在。在这个协议中，我们将介绍一种在体外 激酶测定法可提供有关目的蛋白是否可被PKA磷酸化的初步读数。我们的目的蛋白在细菌中表达后纯化，并用牛心脏的重组PKA处理，然后提取蛋白，并使用蛋白印迹进行蛋白质印迹磷酸化针对PKA靶标的特异性抗体，这将使我们能够快速确定PKA是否可能使我们感兴趣的蛋白质磷酸化。
[背景 ] 激素和其他因素会通过G连接的G蛋白偶联受体（GPCR）激活腺苷酸环化酶并随后促进第二信使cAMP的产生，从而影响细胞迁移等细胞过程。cAMP水平升高会导致PKA激活，丝氨酸-苏氨酸激酶在迁移细胞中肌动蛋白细胞骨架动力学的调节中起着重要作用.PKA影响肌动蛋白细胞骨架调节过程的不同方面，包括a）Rho-fa 微小GTPases （Rho，Rac 和Cdc42）的调节活性， B）肌动蛋白结合蛋白（例如，VASP [血管舒张兴奋剂的UI Ated磷蛋白]），C）激酶间接地控制肌动蛋白结合蛋白（的作用例如，P21活化激酶）和d）肌球蛋白（豪，2004） 。但是，PKA和其他激酶也可以通过磷酸化调节其他蛋白质，目前尚不知道。
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