| AIMTOR, a BRET Biosensor for Live Recording of mTOR Activity in Cell Populations and Single Cells
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Author:
Date:
2021-04-20
[Abstract] Mammalian target of rapamycin (mTOR) controls many crucial cellular functions, including protein synthesis, cell size, energy metabolism, lysosome and mitochondria biogenesis, and autophagy. Consequently, deregulation of mTOR signaling plays a role in numerous pathological conditions such as cancer, metabolic disorders and neurological diseases. Developing new tools to monitor mTOR spatiotemporal activation is crucial to better understand its roles in physiological and pathological conditions. However, the most widely used method to report mTOR activity relies on the quantification of specific mTOR-phosphorylated substrates by western blot. This approach requires cellular lysate preparation, which restricts the quantification to a single time point. Here, we present a simple protocol to ...
[摘要]
[摘要]雷帕霉素（mTOR的）控制许多重要的细胞功能的哺乳动物靶，包括蛋白合成，细胞大小，能量代谢，溶酶体和线粒体生物发生，和自体吞噬。因此，mTOR信号转导的失调在许多病理状况如癌症，代谢紊乱和神经系统疾病中起作用。开发新的工具来监控mTOR的时空激活关键的是要更好地了解它的作用小号在生理和病理条件。但是，最广泛使用的报告mTOR活性的方法取决于对特定mTOR的定量- 磷酸化底物由瓦特西部时代b很多。这种方法需要细胞裂解物的制备，这限制了量化到一个单一的时间点。在这里，我们提出了一个简单的协议来研究mTOR的在活细胞的活性在实时使用AIMTOR，一个分子内BRET基（b ioluminescence ř esonance Ë NERGY吨转让（BOT））的生物传感器，我们最近设计（Bouquier等人，2020） 。我们描述染的AIMTOR中的C2C12细胞系和程序，以监控BRET在用酶标仪细胞群和单细胞显微镜。重要的是，该协议可转座至任何细胞系和原代细胞。另外，已经开发了几种亚细胞区室特异性的AIMTOR版本，使得能够对mTOR活性进行区室化评估。本协议描述了如何使用的敏感AIMTOR生物传感器研究mTOR信号动力学在活细胞中。
图形摘要：
从播种细胞到实时BRET记录的AIMTOR协议概述 ...
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| Measurement of Protein-Protein Interactions through Microscale Thermophoresis (MST)
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] The binding interactions of PD-1 and PD-L1 have been studied by surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC) over the past few years, but these investigations resulted in controversy regarding the values of the dissociation constant (Kd) (Freeman et al., 2000). MST is a powerful new method for the quantitative analysis of protein-protein interactions (PPIs) with low sample consumption. The technique is based on the movement of molecules along microscopic temperature gradients, and it detects changes in their hydration shell, charge or size. One binding partner is fluorescently labeled, while the other binding partner remains label-free. We used a protocol that allows the determination of the binding affinity by MST without purification of ...
[摘要] [摘要 ] 近年来，通过表面等离振子共振（SPR）和等温滴定热法（ITC）研究了PD-1和PD-L1的结合相互作用，但这些研究引起了解离常数值的争议。 （ķ d ）（弗里曼等人，2000） 。MST是一种功能强大的新方法，可定量分析低样品消耗的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。该技术基于分子沿微观温度梯度的移动，并检测其水合壳，电荷或大小的变化。一个结合蛋白摹伴侣荧光拉贝领导， 而另一个绑定伙伴仍保持无标签状态。我们使用的协议允许通过MST确定结合亲和力，而无需从细胞裂解物中纯化靶蛋白。将此MST方法应用于在CHO-K1细胞中表达的PD-1-eGFP和PD-L1-eGFP的应用，首次使我们能够确定PD-1及其配体PD-L1之间形成的复合物的亲和力在肿瘤逃逸期间。该协议在研究蛋白质与小分子之间的相互作用方面具有多种潜在应用。
[背景技术 [ 0002 ] 鉴定能够调节PD-1和PD-L1之间形成的复合物的亲和力的化合物代表了针对肿瘤免疫逃逸的新疗法的开发的重大进展。该方案涉及eGFP 融合蛋白的过表达，然后从细胞裂解物中提取eGFP 融合蛋白，无需任何纯化步骤即可测定PD-1和PD-L1之间的亲和常数。因此，该协议的发展需要产生eGFP 融合蛋白。该协议旨在通过避免繁琐的纯化步骤来定量加速蛋白质相互作用的表征。该协议还可以用于通过PD-1 / ...
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