| Primer ID Next-Generation Sequencing for the Analysis of a Broad Spectrum Antiviral Induced Transition Mutations and Errors Rates in a Coronavirus Genome
|
|
Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] Next generations sequencing (NGS) has become an important tool in biomedical research. The Primer ID approach combined with the MiSeq platform overcomes the limitation of PCR errors and reveals the true sampling depth of population sequencing, making it an ideal tool to study mutagenic effects of potential broad-spectrum antivirals on RNA viruses. In this report we describe a protocol using Primer ID sequencing to study the mutations induced by antivirals in a coronavirus genome from an in vitro cell culture model and an in vivo mouse model. Viral RNA or total lung tissue RNA is tagged with Primer ID-containing cDNA primers during the initial reverse transcription step, followed by two rounds of PCR to amplify viral sequences and incorporate sequencing adaptors. Purified and pooled ...
[摘要] [摘要]下一代测序（NGS）已成为生物医学研究的重要工具。结合MiSeq平台的Primer ID方法克服了PCR错误的局限性，并揭示了群体测序的真实采样深度，使其成为研究潜在的广谱抗病毒剂对RNA病毒的诱变作用的理想工具。在本报告中，我们描述了一种使用引物ID测序的方案，用于研究体外细胞培养模型和体内小鼠模型中冠状病毒基因组中抗病毒药诱导的突变。在最初的反转录步骤中，病毒RNA或总肺组织RNA用含Primer ID的cDNA引物标记，然后进行两轮PCR扩增病毒序列并整合测序适配器。使用MiSeq平台对纯化和合并的文库进行测序。测序数据使用模板共有序列（TCS）网络应用处理。引物ID方法提供了一种精确的测序方案，可以测量病毒RNA基因组和宿主mRNA中的突变错误率。测序结果表明，β-D-N4-羟基胞嘧啶核苷（NHC）大大提高了病毒RNA基因组中的过渡取代率，但并未显着提高颠覆取代率，并且发现胞嘧啶（C）至尿苷（U）是最常见的突变。
[背景]下一代测序（NGS）已被广泛应用在生物医学研究中使用在过去十年。当应用NGS研究宿主内病毒种群的RNA病毒时，需要考虑对文库制备和测序方案的修改。样本之间的病毒滴度（或病毒载量）差异很大。传统的NGS平台在测序运行中需要1-500 ng的DNA（或RNA），但在大多数情况下，临床样品中的病毒RNA少于100 ...
|
|
|
| Estimation of the Minimum Number of Replication Origins Per Chromosome in any Organism
|
|
Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] Eukaryote nuclear genomes predominantly replicate through multiple replication origins. The number of replication origins activated per chromosome during the S-phase duration may vary according to many factors, but the predominant one is replication stress. Several studies have applied different approaches to estimate the number and map the positions of the replication origins in various organisms. However, without a parameter to restrict the minimum of necessary origins, less sensitive techniques may suggest conflicting results. The estimation of the minimum number of replication origins (MO) per chromosome is an innovative method that allows the establishment of a threshold, which serves as a parameter for genomic approaches that map origins. For this, the MO can be easily ...
[摘要] [摘要] 比率可能因多种因素而变化，但最主要的因素是复制应力。一些研究应用了不同的方法来估计复制源在不同生物体中的数量和位置。然而，如果没有一个参数来限制必要起源的最小值，那么不太敏感的技术可能会产生相互矛盾的结果。估计每个染色体的最小复制源数量（MO）是一种创新的方法，它允许建立一个阈值，作为绘制起源的基因组方法的参数。为此，MO可以很容易地通过一个公式得到，这个公式需要作为参数：染色体大小、S期持续时间和复制率。在基因组数据库（如NCBI）中可以获得任何生物体的染色体大小，通过监测DNA复制来估计S期的持续时间，并通过DNA组合方法获得复制率。 提供了一种简单、快速的估算MO的方法一个新的方法学框架来协助研究任何有机体。
关键词： DNA复制，复制来源，复制率，S期持续时间，染色体大小
[背景] ...
|
|
|
| Calcein Release Assay to Measure Membrane Permeabilization by Recombinant Alpha-Synuclein
|
|
Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] Lipid membranes are involved in regulating biochemical and biological processes and in modulating the selective permeability of cells, organelles, and vesicles. Membrane composition, charge, curvature, and fluidity all have concerted effects on cellular signaling and homeostasis. The ability to prepare artificial lipid assemblies that mimic biological membranes has enabled investigators to obtain considerable insight into biomolecule-membrane interactions. Lipid nanoscale assemblies can vary greatly in size and composition and can consist of a single lipid monolayer, a bilayer, or other more complex assemblies. This structural diversity makes liposomes suitable for a wide variety of biochemical and clinical applications. Here, we describe a calcein dye leakage assay that we have developed ...
[摘要] [摘要] 脂质膜参与调节生物化学和生物过程，并调节细胞，细胞器和囊泡的选择性通透性。膜的组成，电荷，曲率和流动性均对细胞信号传导和体内平衡具有协同作用。制备模拟生物膜的人工脂质组装体的能力使研究人员能够深入了解生物分子与膜之间的相互作用。脂质纳米级装配体的大小和组成可以有很大不同，并且可以由单个脂质单层，双层或其他更复杂的装配体组成。这种结构上的多样性使脂质体适用于多种生化和临床应用。在这里，我们描述了一种钙黄绿素染料泄漏测定法，该测定法已开发用于监测磷脂酰小泡被α-突触核蛋白（ αSyn）破坏，α-突触核蛋白是一种突触前蛋白，在帕金森氏病（PD）中起着重要作用。我们目前的数据显示的效果腺苷酰化的α Syn的上α 的Syn 介导囊泡破裂，例如，此法可用于研究基因突变或翻译后修饰的作用，对α 的Syn -membrane相互作用，以确定蛋白质结合合作伙伴或扰乱这些相互作用的化学实体，并以研究的渗透活动不同血脂的影响α Syn 或其他任何蛋白质。
背景技术脂质体是由于脂质头基团和脂肪酸侧链之间的亲水和疏水相互作用而形成的纳米级脂质组装体。这些生物膜模仿脂质双层组件是研究蛋白质生物分子的膜相互作用的有用工具，这是由于：（i ）调节脂质体直径的灵活性，从而调节膜曲率；（ii）控制脂质成分（Ahmed 等，2019；Siontorou ...
|
|
|