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Date:
2020-04-05
[Abstract] High magnetic field Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometers provide extremely high mass resolution (resolving power of ~200,000 at 400 m/z) protein detection across a broad mass range, enabling analysis of fine structure of isotopic peak clusters that is missed in other types of mass spectrometers. The protocol detailed here describes preparation of cellular extracts for purification of DNA-binding proteins using multiple chromatographic chemistries via fast protein liquid chromatography (FPLC), and identification and quantitation of the protein isoforms and their post-translational modifications by liquid chromatography coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC-FT-ICR-MS). This protocol benefits from selectively purifying ...
[摘要] [摘要] 高磁场傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪可在较宽的质量范围内提供极高的质量分辨率（在400 m / z处的分辨力约为200,000），可对同位素峰簇的精细结构进行分析在其他类型的质谱仪中被遗漏了。此处详细介绍的协议描述了使用多种色谱化学方法通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）制备用于纯化DNA结合蛋白的细胞提取物的方法，以及通过液相色谱与傅立叶变换耦合对蛋白质同工型及其翻译后修饰的鉴定和定量离子回旋共振质谱（LC-FT-ICR-MS）。该协议受益于通过高分辨率FT-ICR选择性纯化蛋白质以进行鉴定和定量的方法，该技术具有确定性地区分乙酰化和三甲基化翻译后修饰（PTM）添加的能力。
[背景 ] 蛋白质翻译后修饰（翻译后修饰）的细胞过程和功能的调控中发挥非常重要的作用。由于大量潜在的修饰和可以修饰的氨基酸残基数量，PTM的表征具有挑战性。对于蛋白水解位点数量有限，无法以蛋白水解消化形式进行分析且需要完整的蛋白MS分析的蛋白质而言，尤其如此。为实现此目标，该方案描述了通过HPLC分离蛋白质和高精度/高分辨率质谱的方法。HPLC分离至：1 ）从目标蛋白质中消除各种盐和其他干扰分子，2 ）分离蛋白质的各种PTM亚型，3 ...
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