| Non-radioactive Assay to Determine Product Profile of Short-chain Isoprenyl Diphosphate Synthases
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Isoprenoids represent the largest class of metabolites with amazing diversities in structure and function. They are involved in protecting plants against pathogens or herbivores or involved in attracting pollinators. Isoprenoids are derived from geranyl diphosphate (GPP; C10), farnesyl diphosphate (FPP; C15), geranylgeranyl diphosphate (GGPP; C20), and geranylfarnesyl diphosphate (GFPP; C25) that are in turn formed by sequential condensations of isopentenyl diphosphate (IPP; C5) with an allylic acceptor such as dimethylallyl diphosphate (DMAPP; C5), GPP, FPP, or GGPP in a reaction catalyzed by isoprenyl diphosphate synthases (IDSs). IDS enzyme assay for determination of prenyl diphosphate products is generally performed ...
[摘要] [Abstrac吨]类异戊二烯代表最大的一类代谢物在结构和功能惊人多样性。它们参与保护植物免受病原体或草食动物侵害，或参与吸引传粉媒介。（;çGPP类异戊二烯是从牻牛儿基二磷酸衍生的10 ），法呢基二磷酸（FPP;Ç 15 ），香叶基香叶基二磷酸（GGPP;Ç 20 ），和geranylfarnesyl二磷酸（GFPP; C ^ 25 ），它们又通过的顺序缩合形成异戊烯基二甲基磷酸酯（IPP; C 5 ）与烯丙基受体，例如二磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP; C 5），GPP，FPP或GGPP）由异戊二烯基二磷酸合酶（IDS）催化的反应。用于确定异戊二烯基二磷酸酯产物的IDS酶测定法通常是使用放射性标记的底物进行的，并且所形成的产物是通过使用昂贵的仪器（例如磷光成像仪，radio-GC或radio-HPLC）来鉴定的。尽管已经报道了一种用于测量粗植物提取物中IDS活性的非放射性测定方法，但它需要使用色谱结合串联质谱（LC / MS-MS）的复杂方法。在这里，我们描述了用于确定使用非放射性标记的IPP及其共同烯丙基底物DMAPP，GPP的IDS分析产物非放射性和简单廉价的测定法，和FPP。在测定中生成的异戊二烯基二磷酸产物的检测非常高效，并且在浓度大于40 µM的IPP和DMAPP / GPP / ...
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| Preparation, FPLC Purification and LC-FT-ICR-MS of Proteins
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] High magnetic field Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometers provide extremely high mass resolution (resolving power of ~200,000 at 400 m/z) protein detection across a broad mass range, enabling analysis of fine structure of isotopic peak clusters that is missed in other types of mass spectrometers. The protocol detailed here describes preparation of cellular extracts for purification of DNA-binding proteins using multiple chromatographic chemistries via fast protein liquid chromatography (FPLC), and identification and quantitation of the protein isoforms and their post-translational modifications by liquid chromatography coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC-FT-ICR-MS). This protocol benefits from selectively purifying ...
[摘要] [摘要] 高磁场傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪可在较宽的质量范围内提供极高的质量分辨率（在400 m / z处的分辨力约为200,000），可对同位素峰簇的精细结构进行分析在其他类型的质谱仪中被遗漏了。此处详细介绍的协议描述了使用多种色谱化学方法通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）制备用于纯化DNA结合蛋白的细胞提取物的方法，以及通过液相色谱与傅立叶变换耦合对蛋白质同工型及其翻译后修饰的鉴定和定量离子回旋共振质谱（LC-FT-ICR-MS）。该协议受益于通过高分辨率FT-ICR选择性纯化蛋白质以进行鉴定和定量的方法，该技术具有确定性地区分乙酰化和三甲基化翻译后修饰（PTM）添加的能力。
[背景 ] 蛋白质翻译后修饰（翻译后修饰）的细胞过程和功能的调控中发挥非常重要的作用。由于大量潜在的修饰和可以修饰的氨基酸残基数量，PTM的表征具有挑战性。对于蛋白水解位点数量有限，无法以蛋白水解消化形式进行分析且需要完整的蛋白MS分析的蛋白质而言，尤其如此。为实现此目标，该方案描述了通过HPLC分离蛋白质和高精度/高分辨率质谱的方法。HPLC分离至：1 ）从目标蛋白质中消除各种盐和其他干扰分子，2 ）分离蛋白质的各种PTM亚型，3 ...
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