| An in vitro Assay to Screen for Substrates of PKA Using Phospho-motif-specific Antibodies
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Kinases function as regulators of many cellular processes such as cell migration. These enzymes typically phosphorylate target motif sequences. Mass spec or phospho-specific antibody detection can be used to determine whether a kinase can phosphorylate proteins of interest, however, mass spec can be expensive and phospho-antibodies for the protein of interest may not exist. In this protocol, we will describe an in vitro kinase assay to provide a preliminary readout on whether a protein of interest may be phosphorylated by PKA. Our protein of interest is purified after expression in bacteria and treated with recombinant PKA from bovine heart. Protein is then extracted and a western blot is performed using a phospho-specific antibody for PKA’s target motif. This will allow us to ...
[摘要] [摘要 ] 激酶可充当许多细胞过程（例如细胞迁移）的调节剂，这些酶通常可磷酸化靶基序序列，质谱或磷酸特异性抗体检测可用于确定激酶是否可磷酸化目标蛋白。能成为规格昂贵和磷酸化抗体蛋白的兴趣可能就不存在。在这个协议中，我们将介绍一种在体外 激酶测定法可提供有关目的蛋白是否可被PKA磷酸化的初步读数。我们的目的蛋白在细菌中表达后纯化，并用牛心脏的重组PKA处理，然后提取蛋白，并使用蛋白印迹进行蛋白质印迹磷酸化针对PKA靶标的特异性抗体，这将使我们能够快速确定PKA是否可能使我们感兴趣的蛋白质磷酸化。
[背景 ] 激素和其他因素会通过G连接的G蛋白偶联受体（GPCR）激活腺苷酸环化酶并随后促进第二信使cAMP的产生，从而影响细胞迁移等细胞过程。cAMP水平升高会导致PKA激活，丝氨酸-苏氨酸激酶在迁移细胞中肌动蛋白细胞骨架动力学的调节中起着重要作用.PKA影响肌动蛋白细胞骨架调节过程的不同方面，包括a）Rho-fa 微小GTPases （Rho，Rac 和Cdc42）的调节活性， B）肌动蛋白结合蛋白（例如，VASP [血管舒张兴奋剂的UI Ated磷蛋白]），C）激酶间接地控制肌动蛋白结合蛋白（的作用例如，P21活化激酶）和d）肌球蛋白（豪，2004） 。但是，PKA和其他激酶也可以通过磷酸化调节其他蛋白质，目前尚不知道。
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| Preparation, FPLC Purification and LC-FT-ICR-MS of Proteins
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] High magnetic field Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometers provide extremely high mass resolution (resolving power of ~200,000 at 400 m/z) protein detection across a broad mass range, enabling analysis of fine structure of isotopic peak clusters that is missed in other types of mass spectrometers. The protocol detailed here describes preparation of cellular extracts for purification of DNA-binding proteins using multiple chromatographic chemistries via fast protein liquid chromatography (FPLC), and identification and quantitation of the protein isoforms and their post-translational modifications by liquid chromatography coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC-FT-ICR-MS). This protocol benefits from selectively purifying ...
[摘要] [摘要] 高磁场傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪可在较宽的质量范围内提供极高的质量分辨率（在400 m / z处的分辨力约为200,000），可对同位素峰簇的精细结构进行分析在其他类型的质谱仪中被遗漏了。此处详细介绍的协议描述了使用多种色谱化学方法通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）制备用于纯化DNA结合蛋白的细胞提取物的方法，以及通过液相色谱与傅立叶变换耦合对蛋白质同工型及其翻译后修饰的鉴定和定量离子回旋共振质谱（LC-FT-ICR-MS）。该协议受益于通过高分辨率FT-ICR选择性纯化蛋白质以进行鉴定和定量的方法，该技术具有确定性地区分乙酰化和三甲基化翻译后修饰（PTM）添加的能力。
[背景 ] 蛋白质翻译后修饰（翻译后修饰）的细胞过程和功能的调控中发挥非常重要的作用。由于大量潜在的修饰和可以修饰的氨基酸残基数量，PTM的表征具有挑战性。对于蛋白水解位点数量有限，无法以蛋白水解消化形式进行分析且需要完整的蛋白MS分析的蛋白质而言，尤其如此。为实现此目标，该方案描述了通过HPLC分离蛋白质和高精度/高分辨率质谱的方法。HPLC分离至：1 ）从目标蛋白质中消除各种盐和其他干扰分子，2 ）分离蛋白质的各种PTM亚型，3 ...
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